ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键VIP专享

ELLMAN 试剂测定自由巯基 试验基于的原理： 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm 没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。TNB2-在412nm 有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。 SSNO2NO2-OOC-OOC+SHS -SNO2NO2-OOC-OOC+S DTNB TNB2- 根据文献记载，TNB 的吸光系数在13.6*103M-cm-~14.25*103M-cm-之间[3,4]。吸光度测量的最灵敏范围在0.2-0.7 之间。A=εbc，其中A 为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]。以吸光度下限 0.2 来计算（吸光系数取14.15*103M-cm-），需要 TNB 的浓度为c=0.2/（14.15*103LM-cm-*1cm）=1.4*10-5mol/L (1.4*10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为1.4*10-5mol/L*18790g/mol=0.2631g/L=0.2631mg/ml. 我们的条件可以达到这个检测限度。 ELLMAN 试剂法测定自由巯基主要的影响因素有： 1. EDTA 的适量加入有助于TNB 显色的稳定和成梯度线性关系[5]。 2. 在不同缓冲液中，TNB 的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm 的吸收也不 3. 同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。另外，TNB 的分光光度法分析对SDS 很敏感[6]。 4. DTNB 随着 pH 的升高，降解速度加快。在pH7.0，其降解速度为0.02%/h，在 5. pH 值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH 值得升高，降解速度加快，在pH 12 时，15min 之内会完全降解[7,8]。 6. 摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4]. 试验方案 主要材料： 1.材料 PEG-G-CSF 批号：080229 浓度4.32mg/ml G-CSF 批号：080126 浓度6.9mg/ml 10k 超滤膜 PALL 2.试剂 Sequ encing Grade Modified Try psin,Promega，lot#237826。20 u g/小瓶。加入20 u l 50mM NH4HCO3，pH7.8 溶解，配成1 u g/ u l 的酶液。 1M DTT 刘春凤提供 TFA（三氟乙酸）：TEDIA Lot# 705114 乙腈：Fisher Scientific Lot# 055848 Starter kit for MALDI-TOF MS ：BRUKER DALTONICS ，Lot NO 2007-208241-001(inclu ding α -Cy ano-4-hy drox y cinnamic acid(HCCA),peptide calibration standard,protein calibration standard I,protein calibration standard Ⅱ) PEG 肽段反相分离流动相 A 液：0.1%TFA/H2O B 液：0.1%TFA/90%乙...