试 验 抗日本血吸虫卵黄抗体的制备与鉴定 材料与方法 1 .1 主要试剂 正辛酸 天津市弗晨化学试剂厂 批号200101(分析纯) 硫酸铵 天津市四通化工厂(分析纯) 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB) Amresco 批号T2007/10 二甲基亚砜(DMSO) 郑州化学试剂厂 批号20030224 十二烷基磺酸(SDS) 北京鼎国生物技术公司 Sigma 进口分装 L5750 丙烯酰胺 沃德赛斯生物技术有限公司Sigma 进口分装A8887 羊抗鸡IgY(FITC 标记) Promega 公司 低分子量标准蛋白质 中科院上海生物化学研究所 DAB Amresco C069 DTT Genview DH116-2 1 .2 试剂的配制 1.2.1 提取蛋白用试剂的配制 (1)饱和硫酸铵溶液 (NH4)2SO4 760g, 蒸馏水(50~80℃) 1000mL 搅拌溶解 20 分钟,趁热过滤冷却后以浓氨水(NH3·H2O)调 PH 至 7.0~7.4,配制好的饱和硫酸铵置 4℃处置 30 min 以上,瓶底应有结晶析出,用时应置室温平衡后再用。 (2)醋酸缓冲液(0.06M,pH4.8) 醋酸钠 4.082g 冰乙酸 1.815g(约 1.7 mL ) 1.2.1 ELISA 用试剂 (1)包被液(0.05M pH9.6 碳酸钠缓冲液) 无水Na2CO3 1.59g NaHCO3 2.93g 蒸馏水加至 1000 mL (2)洗涤液(0.01M pH7.4 磷酸盐缓冲液)PBST NaCL 8.0g KCL 0.2g KH2PO4 0.2g Na2HPO4•12H2O 2.9g 吐温-20 0.5mL 蒸馏水加至1000 mL (3)封闭液(1% BSA-PBST) 牛血清白蛋白(BSA) 1g 洗涤液 PBST 100mL (4)底物缓冲液(pH5.0 柠檬酸-磷酸缓冲液) 0.1M 柠檬酸 (19.2g/L) 24.3mL 0.2M Na2HPO4 (28.4g/L) 25.7mL 蒸馏水 50mL (5)TMB 底物使用液 TMB 储存液(100mg 溶于 10mLDMSO,4℃保存) 100µL 底物缓冲液 10mL 30%H2O2 10µL (临用新鲜配制) (6)终止液(2M H2SO4) H2SO4(96%) 22.2mL 蒸馏水 177.8mL 1.2.3 SDS-PAGE 电泳用试剂 (1)10%(w/v)SDS 溶液 十二烷基硫酸钠(SDS) 10g 蒸馏水 100mL (室温保存) (2)10%(w/v)过硫酸铵(AP) 过硫酸铵 1g 蒸馏水 10mL (临用前新鲜配制, 4℃保存<1 周) (3)30%丙烯酰胺混合液 丙烯酰胺 29.2g 二甲基双丙烯酰胺 0.8g 蒸馏水定容至100mL,棕色瓶4℃贮存 (4)分离胶缓冲液(1.5M pH8.8Tris-HCl) Tris 18.2g 少量蒸馏水溶解 HCl(1M) 调 pH 至8.8 蒸馏水定容至100mL,4℃贮存 (5)浓缩胶缓冲液(1.0M pH6.8T...