免疫共沉淀原理及实验方法

注册┆登录┆发表文章  免疫共沉淀原理及实验方法 2007-03-22 16:07:46 大 中 小 免疫共沉淀 一 原理： IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在 argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。 实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在 IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。 其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使 IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。 再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。 每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在 beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。欲速则不达，确定好比例很必要。(待续) 二 准备： 器械 #微量高速冷冻离心机 #移液枪 #旋转盘 #电泳设备 #vortex震荡器 #液氮及组织粉碎器 #eppentube 试剂 #细胞或组织 #蛋白定量kit #SDS电泳试剂 #抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清) #PBS #NaN3 #proteinA sapharose 试剂配制 抗原蛋白溶解缓冲液 1.RIPA缓冲液 (最终浓度) 1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM) 5MNacl 15ml (150mM) 0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM) 20%TritonX-100 25ml (1%) 10% DOC 50ml (1%) 10%SDS 5ml ( o.1%) TLCK 18.5mg (0.1mM) TPCK 35mg (0.2mM) DDW 395ml toal 500ml 另外，使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精，浓度100mM，-20度遮光保存。注意不易溶于水) 2.NP40 lysis 缓冲液 1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM) 5MNacl 15ml (150mM) 0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM) 20%NP40 25ml (1%) TLCK 18.5mg (0.1mM) TPCK 35mg (0.2mM) DDW 450ml toal 500ml 使用前加1mM的 PMSF 注意点： *...