免疫组化操作步骤 一 免疫组化（ LP 法）操作步骤 ： 1． 切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行 2. 缓冲液洗 3min/2 次。 3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。 4. 缓冲液洗 5min/2 次。 5. 滴加 Ultra V Block ， 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。 （注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略。） 6. 缓冲液洗 5min/2 次。 7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。（具体孵育时间和温度由试验者最终决定） 8. 缓冲液洗 5min/2 次。 9 ． 滴加 Primary Antibody Enhancer( 增强子 ) , 在室温下孵育 20 分钟。 10 ．缓冲液洗 5min/2 次。 11 ．滴加 HRP Polymer( 酶标二抗 ) ，在室温下孵育 30 分钟。 （注： HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。） 12 ．缓冲液洗 5min/2 次。 13 ．向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。（具体时间由染色深浅决定。） 14 ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片。 二．免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤 ： （ 1 ）、石蜡切片脱蜡至水。 （ 2 ）、 3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 （ 3 ）、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。 （ 4 ）、 5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿 洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小时或 4 ℃ 过夜 。 （ 5 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。 （ 6 ）、滴加适量 生物素标记二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。 （ 7 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。 （ 8 ）、滴加适量的 辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。 （ 9 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。 （ 10 ）、显色剂显色 3-15 分钟（ DAB 或 NBT/BCIP ） （ 11 ）、自来水充分冲洗，复染，脱水...
