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原位杂交组织化学的方法和常用试剂配制

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原位杂交组织化学的方法和常用试剂配制 一、杂交前准备 (一)DEPC 水是经 DEPC 处理过的灭菌蒸馏水。 DEPC 即二乙基焦碳酸酯(diethy lprocarbonate),可灭活各种蛋白质,是 RNA 酶的强抑制剂。原位杂交在杂交及其以前的各步处理中,所有液体试剂都应经 DEPC 处理。方法是:取市售 DEPc 1ml,加入 1L 待处理水(蒸馏水等)中,经猛烈振摇后,于室温静止数小时,然后高压灭菌,以除去降解 DEPC(DEPC 分解为 CO2 和乙醇)。有些试剂可直接加入 DEPC,终浓度一般为 0.1%~0.4%,原则上在杂交及其以前的步骤中,所有液体试剂均需用 DEPC 处理,或用 DEPC 水配制,包括乙醇的稀释。此外,接触标本以及标本有关的空中的洗涤也需 DEPC 水洗涤。 注意:DEPC 是一种潜在的致癌物质,在操作中应尽量在通风的条件下进行,并避免接触皮肤。②含有 Tris 缓冲液的溶液中,不能加入 DEPC。 (二)载玻片的处理 组织原位杂交,常在载玻片上进行,故载玻片的洗涤至关重要,必须保持清洁,并且不能有任何核酸的污染。处理方法如下: (1)先经洗衣粉浸泡过夜,次日自来水冲洗后,泡酸数小时以上,取出后再用流水冲洗,双蒸水冲洗 2~3 次,置160℃以上烤箱中烧烤 4h 以上,或经 15 磅高压灭菌 20min。经以上处理可清除载片上的核酸酶。 (2)HCl 处理法 试剂: 1M HCL, DEPC 水, 95%乙醇 步骤: a. 玻片在室温下于 1M HCL 中浸泡30 分钟 b. DEPC 水中洗片 c. 95%乙醇中洗片 d. 空气中干燥 e. 重复一遍 a—d. f. 铝箔包好备用. (三)硅化 【方法1】(1)将一扎新的盖玻片散开,在通风条件下于0.1mol/L 的HCI 中煮20min,等其冷却后,倒掉盐酸。 (2)用去离子水沉漂洗玻片,竖放在架子上自然干燥。 (3)硅化盖玻片:通风条件下,将单块的盖玻片在二甲二氯硅浣(dimethy ldichorsilane,DMDC)液中浸几下,竖入在架子上干燥。 (4)收集干燥的盖玻片于一可耐热的petri 氏盘(或培养皿)中,用去离子水漂洗数次,彻底清洗。 (5)用铝箔将装有盖玻片的培养皿包好,于180℃烘烤 4h 过夜。取出待冷至室温后,即可进行后续处理。 附:2%DMDC DMDC 2ml 三氯乙烷 98ml 配制:按比例两者充分混匀,静止待气泡消失即可使用。 用途:硅化玻片(载片、盖片均可)。 【方法2】将经过洗净的玻璃盖片分散开放在一金属网中,并将该网放入一接有真空泵的干燥器中。同时,在干燥器中放一盛...

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