原位杂交组织化学的方法和常用试剂配制VIP专享

原位杂交组织化学的方法和常用试剂配制 一、杂交前准备 （一）DEPC 水是经 DEPC 处理过的灭菌蒸馏水。 DEPC 即二乙基焦碳酸酯（diethy lprocarbonate），可灭活各种蛋白质，是 RNA 酶的强抑制剂。原位杂交在杂交及其以前的各步处理中，所有液体试剂都应经 DEPC 处理。方法是：取市售 DEPc 1ml，加入 1L 待处理水（蒸馏水等）中，经猛烈振摇后，于室温静止数小时，然后高压灭菌，以除去降解 DEPC（DEPC 分解为 CO2 和乙醇）。有些试剂可直接加入 DEPC，终浓度一般为 0.1%～0.4%，原则上在杂交及其以前的步骤中，所有液体试剂均需用 DEPC 处理，或用 DEPC 水配制，包括乙醇的稀释。此外，接触标本以及标本有关的空中的洗涤也需 DEPC 水洗涤。 注意：DEPC 是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。②含有 Tris 缓冲液的溶液中，不能加入 DEPC。 （二）载玻片的处理 组织原位杂交，常在载玻片上进行，故载玻片的洗涤至关重要，必须保持清洁，并且不能有任何核酸的污染。处理方法如下： （1）先经洗衣粉浸泡过夜，次日自来水冲洗后，泡酸数小时以上，取出后再用流水冲洗，双蒸水冲洗 2～3 次，置160℃以上烤箱中烧烤 4h 以上，或经 15 磅高压灭菌 20min。经以上处理可清除载片上的核酸酶。 （2）HCl 处理法 试剂: 1M HCL, DEPC 水, 95%乙醇 步骤: a. 玻片在室温下于 1M HCL 中浸泡30 分钟 b. DEPC 水中洗片 c. 95%乙醇中洗片 d. 空气中干燥 e. 重复一遍 a—d. f. 铝箔包好备用. （三）硅化 【方法１】（1）将一扎新的盖玻片散开，在通风条件下于0.1mol/L 的HCI 中煮20min,等其冷却后,倒掉盐酸。 （2）用去离子水沉漂洗玻片，竖放在架子上自然干燥。 （3）硅化盖玻片：通风条件下，将单块的盖玻片在二甲二氯硅浣（dimethy ldichorsilane,DMDC）液中浸几下，竖入在架子上干燥。 （4）收集干燥的盖玻片于一可耐热的petri 氏盘（或培养皿）中，用去离子水漂洗数次，彻底清洗。 （5）用铝箔将装有盖玻片的培养皿包好，于180℃烘烤 4h 过夜。取出待冷至室温后，即可进行后续处理。 附：2%DMDC DMDC 2ml 三氯乙烷 98ml 配制：按比例两者充分混匀，静止待气泡消失即可使用。 用途：硅化玻片（载片、盖片均可）。 【方法2】将经过洗净的玻璃盖片分散开放在一金属网中，并将该网放入一接有真空泵的干燥器中。同时，在干燥器中放一盛...