双向电泳笔记

1.当你在首次对未知样品进实验时，建议你使用以下的样品溶液： 将蛋白溶解在： ·8M 尿素，4%CHAPS, 60 mM DTT, 2% Pharmalyte 3-10, 0.002%溴酚蓝。 溶解大蛋白或疏水蛋白量更难溶的蛋白可以使用以下方法： ·7M 尿素，2M 硫脲，4%CHAPS, 60M DTT, 2% Pharmalyte pH 3-10, 0.002% 溴酚蓝。 2. 为了从蛋白含量很低并且含有大量干扰物质的组织（如植物组织）中制备样品，你可以使用以下推荐方法。该方法产生的蛋白溶液中不包含盐，核酸及其它污染物。 · 将组织在研钵中用液氮研碎。将粉末悬浮在含有 10%TCA，0.3%DTT 的丙酮中。在-18˚C 条件下过夜并离心。用丙酮清洗沉淀，干燥沉淀并将沉淀溶于 9M 尿素，2%CHAPS,1%DTT,2% Pharmalyte 3-10(52,63)中。 3.等电聚焦在变性条件下进行，能产生高分辩率和高清晰度的结果。利用尿素和去污剂的混合液，能达到完全的变性和溶解，确保各种蛋白质以单一形态存在，并且减少凝集和分子间的相互作用。 尿素（Urea）:使蛋白质溶解和变性，通常使用浓度为 8mol/L，但为了使蛋白质完全溶解的需要，尿素的浓度往往增加到 9 或 9.8mol/L。 CHAPS :促使疏水蛋白质溶解并减少蛋白质间的结合 还原剂：打断二硫键使蛋白质完全展开，往往使用DTT 或 DTE 载体两性电解质混合物：载体两性电解质的混合物在等电聚焦过程中不影响梯度，还能促进样品的溶解度，并且等电聚焦过程中在整个梯度范围内能产生更一致性的导电性。 经典的再水化液组成：8 M urea, 0.5% (w/v)CHAPS, 0.2%(w/v)DTT, 0.5% IPG缓冲液或Pharmalyte, 0.002%溴酚蓝。 ***不要让干燥的IPG 胶条在室温下存留时间超过 10 分钟，胶条会从空气中吸收水分，将IPG胶条密封好在-20℃以下温度保存。再水化至少需要十个小时。 矿物油加入：利用微量移液器从槽的一端逐滴加入，直至一半条胶被覆盖，然后从另一端逐滴加入，直至整条胶被覆盖。 ****聚焦时间过长会发生过聚焦，导致产生水平的条纹,可以在双向电泳的最后结果中见到。 4.可选操作：加入分子量标准蛋白。 分子量标准蛋白溶液与等体积的1%琼脂糖溶液混合后，然后加入到等电聚焦上样滤纸片上能得到很好的效果。终浓度为 0.5%的琼脂糖会凝聚，在施加电压前可以防止标准蛋白的扩散。 其它可选的方法是，将标准蛋白以 15-20 μ l 的体积加入到等电聚焦上样滤纸片上。如要少加样量，将上样滤纸片切成更小的面积。将上样滤纸片放在玻璃板上，将...