载体构建 步骤VIP免费

载体构建分为以下步骤：1.载体的选择和引物设计以扩增目标基因2.目标片段的PCR扩增3.载体和目标片段的限制性酶切4.连接转化5.挑取克隆提质粒6.单克隆的验证及送样测序。载体的选择实验室常用的载体有pUC19（扩繁目标片段），pet28a（原核表达载体Kna+），pGEX-4T-1(原核表达载体Amp+)，pCI-NEO(真核表达载体Amp+)，pCDNA3.1(真核表达载体Amp+)，pLKO.1(shRNA构建Amp+)。根据所要构建的质粒目的的差异以及载体和目标片段的酶切位点分析结果来选择载体。举例如下：实验目的是将MYC基因插入到载体中，转染进细胞中表达。应选用真核表达载体pCI-NEO或pCDNA3.1。引物设计引物设计的目的是将目标片段扩增出来以便与载体连接，所以在引物的两端应人为加上酶切位点，酶切位点前加上保护碱基。在选择酶切位点是应注意，选择的应该是目的基因片段中没有而载体上有的限制性内切酶，防止目标片段被切不完整，也便于和载体连接。载体构建之后我们的目的是要表达，所以应该加入标签以便westernblot检测蛋白是否表达。常用的标签有Flag标签、6XHis标签、HA标签和Myc标签。Flag标签：DYKDDDDKGATTACAAGGATGACGACGATAAG6XHis标签：HHHHHHCACCACCACCACCACCACHA标签：YPYDVPDYATACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTMyc标签：EQKLISEEDL这些标签被表达成氨基酸后，特定的氨基酸序列会与相应抗体结合，在westernblot时可被检测。因此，在设计引物时，这些核酸序列应位于起始密码子ATG之后。翻译是从mRNA的5‘端开始，而蛋白质合成是从N端到C端，所以若要把标签加在N端，标签所对应的核苷酸序列应位于ATG之后，若是加在C端，则应该将标签所对应的核苷酸序列置于终止密码子TAA之前。对于真核表达载体，蛋白在真核生物中表达时切记应加入kozak序列，kozak序列是核糖体在识别mRNA上起始位点时的必须元件，蛋白在翻译表达时时从kozak序列后的第一个ATG开始翻译。并且，kozak序列的存在可以使蛋白的翻译表达效率提高很多倍。根据以上原则，仍然以MYC为例：1.在NCBI中查找MYC的CDS序列。2.将序列复制粘贴至DNAMAN中分析：在这些不含有的酶切位点中选择与载体对应的酶切位点，本次举例选择pCDNA3.1所选择的酶切位点为KpnI和XhoI.引物设计如下：酶切位点Flag标签MYC-PCD-KpnI-Flag-F:GGGGTACCGCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAG保护碱基kozakatgGATTTTTTTCGGGTAGTGGAMYC上游引物酶切位点MYC下游引物MYC-PCD-XhoI--R:CCCTCGAGATTCGCACAAGAGTTCCGTAGCT保护碱基终止子目标片段的PCR扩增和回收因为后续将目的片段插入之后做的是表达，所以不能引入突变，我们实验室用的是Q5高保真酶，PCR扩增体系如下：Q5reactionBuffer10ulQ5GCenhancer10ul模板gDNA(50ng)/cDNA(25ng)/质粒(0.1-1ng)/PCR产物(0.01-0.1ng)dNTP(10mM)1ulF（10uM）1ulR（10uM）1ulQ50.5ulddH2Oto50ulPCR扩增时是呈指数增长，即使只有少量模板，也能得到大量的目标片段，反之若模板含量过多，则会是的引物与模板非特异结合，扩增出非特异片段。引物也不宜加多，引物过量会使得引物自身之间相互结合，扩增之后产生过多的引物二聚体。获得PCR产物之后，产物里有酶，dNTP,引物二聚体和目标片段，所以需要切胶回收获得较纯的目标片段。切胶回收组内有相应的试剂盒，流程如下：（1）紫外灯下切除含有目的基因的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，尽量减少不含目的基因的凝胶量，称重（1mg=1ul），切碎凝胶，装入2mLPCR管中。（2）加入3倍体积的BufferA溶液，75℃水浴锅加热直至凝胶完全融化。（3）加入1/2BufferA体积的BufferB，观察溶液颜色由红变黄，并无明显颗粒，表示凝胶融化完全。（4）吸取上述步骤中的溶液并转移到制备管（置于2ml离心管（试剂盒内提供）中），12,000×g离心1min，弃滤液。（5）将制备管置回离心管，加500μlBufferW1，12,000×g离心1min，弃滤液（6）将制备管置回离心管，加700μlBufferW2，12,000×g离心1min，弃滤液；以同样的方法再用700μlBufferW2洗涤一次。弃滤液。*两次使用BufferW2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。（7）将制备管置回2ml离心管中，12,000×g离心1min。（8）将制备管移入新的1.5ml离心管（试剂盒...