总 RNA 抽提 背景知识 高浓度蛋白质变性剂(如GIT、GuHCl 等)的裂解方法,是抽提 RNA 的首选
总 RNA 的抽提,最重要的是快速裂解细胞膜,至于与基因组 DNA 相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质“缠”住的问题,因为都不会对以后的纯化产生大的影响,可以不考虑
高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜,进而迅速抑制住细胞内的 RNA 酶,确保了 RNA 的完整性
除了极少量不适用该方法的样品–主要是植物,其它绝大部分样品的 RNA 的抽提,都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的
RNA 抽提的问题,简单可归纳为三个:降解、纯度、得率
判断这三个指标的基本手段是:电泳和紫外分光光度仪
降解只能通过电泳判断;纯度和得率主要使用紫外分光光度仪检测,但电泳也可以提供简单参考
要正确解读电泳或者紫外分光光度仪的结果,首先就要对这两个方法有基础的了解
如果抽提基因组 DNA 的最大问题是纯度,那么,抽提总 RNA 的最大问题是降解
降解主要来自两个方面:样品的内源酶的作用和最后溶解用水及离心管的不干净
对大部分实验人员来说,RNA 抽提比基因组 DNA 抽提要困难得多
事实上,现有的 RNA 抽提方法/试剂,如果用于从培养细胞中抽提 RNA,比抽提基因组 DNA 更方便,成功率也更高
那为什么同样的方法用于组织 RNA 的抽提,总会碰到问题呢
组织 RNA 抽提失败的两大现象是:RNA 降解和组织内杂质的残留
关于降解问题,首先看一下为什么从培养细胞中抽提 RNA 不容易降解
现有的 RNA 抽提试剂,都含有快速抑制 Rnase 的成分
在培养细胞中加入裂解液,简单的混匀,即可使所有的细胞与裂解液充分混匀,细胞被彻底裂解
细胞被裂解后,裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的 Rnase,所以 RNA 得以保持完整
也就是说,培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触并被及时