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总RNA提取

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总 RNA 抽提 背景知识 高浓度蛋白质变性剂(如GIT、GuHCl 等)的裂解方法,是抽提 RNA 的首选。总 RNA 的抽提,最重要的是快速裂解细胞膜,至于与基因组 DNA 相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质“缠”住的问题,因为都不会对以后的纯化产生大的影响,可以不考虑。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜,进而迅速抑制住细胞内的 RNA 酶,确保了 RNA 的完整性。除了极少量不适用该方法的样品–主要是植物,其它绝大部分样品的 RNA 的抽提,都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。 RNA 抽提的问题,简单可归纳为三个:降解、纯度、得率。判断这三个指标的基本手段是:电泳和紫外分光光度仪。降解只能通过电泳判断;纯度和得率主要使用紫外分光光度仪检测,但电泳也可以提供简单参考。要正确解读电泳或者紫外分光光度仪的结果,首先就要对这两个方法有基础的了解。 如果抽提基因组 DNA 的最大问题是纯度,那么,抽提总 RNA 的最大问题是降解。降解主要来自两个方面:样品的内源酶的作用和最后溶解用水及离心管的不干净。对大部分实验人员来说,RNA 抽提比基因组 DNA 抽提要困难得多。事实上,现有的 RNA 抽提方法/试剂,如果用于从培养细胞中抽提 RNA,比抽提基因组 DNA 更方便,成功率也更高。那为什么同样的方法用于组织 RNA 的抽提,总会碰到问题呢? 组织 RNA 抽提失败的两大现象是:RNA 降解和组织内杂质的残留。 关于降解问题,首先看一下为什么从培养细胞中抽提 RNA 不容易降解。现有的 RNA 抽提试剂,都含有快速抑制 Rnase 的成分。在培养细胞中加入裂解液,简单的混匀,即可使所有的细胞与裂解液充分混匀,细胞被彻底裂解。细胞被裂解后,裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的 Rnase,所以 RNA 得以保持完整。也就是说,培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触并被及时裂解,所以其RNA 不容易被降解;反过来讲,组织中的 RNA 之所以容易被降解,是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。因此,假定有一种办法,在抑制 RNA活性的同时能使组织变成单个细胞,降解问题也就可以彻底解决了。液氮碾磨就是最有效的这样一种办法。但是,液氮碾磨方法非常麻烦,如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。这样就产生了退而求其次的方法:匀浆器。匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制 Rnase 活性这个问题,而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的 Rnase 降解 RNA 的...

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