悬浮细胞传代及细胞计数 一、 细胞传代 实验目的：掌握悬浮细胞传代技术。进一步掌握细胞培养的操作技术。 实验原理： 培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。 实验用品： （一）仪器 净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱； （二）玻璃器皿 吸管（弯头、直头）、培养瓶、废液缸、 （三）塑料器皿 吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml 离心管、离心管架 （四）其他物品 微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪 （五）试剂 1640 培养液、PBS 操作步骤： 1. 准备： 打开培养液，PBS； 取出离心管，拧开管盖，管盖倒放。从吸管筒中 依 次 取出吸管，装 上 吸头，插 入 离心管备用。 2. 从培养箱内取出细胞，放在 显微镜下 观 察 其生长状 态 、密度。 3. 首 先 观 察 培养板孔 中 培养液量。用吸管分别 吸出两 个 孔 中 的细胞连 同 培养液，转 入 离心管中 。再另 取一只 吸管吸取PBS，放入 培养板孔 中 ，轻 轻 吹 打孔 壁 ，吸出转入离心管。 4. 离心，设置离心机1000 转/分，4-5 分钟。 5. 取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。吸取培养液约7ML 放入离心管，轻轻吹打细胞，使之均匀悬浮。 6. 吸取1ML 细胞悬液1ML 转入EP 管中，备计数用。 7. 其余的细胞分别放入六个孔中，每孔约1ML。 8. 吸取培养液加入板孔中至1/3 孔容量。 9. 镜下观察细胞是否分布均匀，放入培养箱培养。 二、细胞计数及生长曲线测定 培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期 潜伏期(latent phase) 细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关。一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即可贴壁。细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期.原代培养细胞潜伏期长，约24-96 小时或更长, 连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅需6-24 小时。 (2) 指数增生期(logarithmic growth phase) 这是细胞增...
