慢病毒介导的 RNAi 技术 一、概述 慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1（人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。和一般的逆转录病毒载体不同，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。并且它可以有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，因此具有广阔的应用前景。 目前慢病毒被广泛地应用于 RNAi 的研究中。由于体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体, 然后转入细胞内转录siRNA 的策略，不但对基因表达抑制效果不逊色于体外合成 siRNA，而且稳定整合表达载体的细胞中，可以发挥长期阻断基因表达的作用。但上述两种方法，一是受到转染试剂转染效率的影响，在一些细胞内无法有效敲低（Knockdown）一些基因；二是传统方法得到稳定细胞株通常需要挑取单克隆，进行克隆化，这样费时费力。利用慢病毒介导的方法可以解决上述问题，这是因为慢病毒介导的 RNAi 具有下述优点： ● 慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，不存在某些细胞难以转染的问题。 ● 慢病毒可以在细胞基因组上稳定整合表达 siRNA 的元件，siRNA 表达效率比较均一，因此，无需挑取单克隆。 ● 慢病毒载体具有嘌罗霉素（Puromycin）抗性基因，Puromycin 可以在 2-3 天内杀死细胞，只有整合了病毒载体的细胞能够存活，这样缩短了得到稳定细胞株的时间。 慢病毒表达载体中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的，这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾。当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3’端形成 1~4 个 U。U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21nt RNA 和～50nt RNA 茎环结构（stem loop）。在 siRNA 表达载体中，构成 siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成 siRNA；也可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体内的位于RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4～5Ｔ转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后可折叠成具有 1~4 个 U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细...
