核酸的分离与纯化 核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子分开。 在分离核酸时，应遵循两个原则：一是保证核酸一级结构的完整性，因为完整的一级结构是核酸结构和功能研究的最基本的要求；二是尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。 核酸分离与纯化的过程一般都包括了材料的选择、核酸的释放、核酸与其它生物大分子的分离、核酸的纯化与鉴定、核酸的浓缩、保存等几个主要步骤。 每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。 一、材料的选择 临床常见的标本血液、组织及体外培养的细胞等都可作为提取核酸的原料，具体实验材料的选择应根据实验的目的来确定。 二、核酸的释放 （一）机械法 包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎，但机械力也可引起高分子量线性分子的断裂，因而不适用于染色体 DNA的分离纯化。 （二）化学法 在一定的 pH 环境下，加入表面活性剂或强离子剂使细胞裂解，蛋白质和多糖沉淀， 核酸被从细胞内释放出来。向缓冲液中加入一些金属离子螯合剂抑制核酸酶的活性，保护核酸不被降解。 （三）酶法 通过加入溶菌酶或蛋白酶（如蛋白酶K）使细胞破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。 溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖 N-乙酰葡糖胺和 N-乙酰胞壁酸残基间的β -1,4 键水解。蛋白酶K 能催化水解多种肽键，且在 65℃及有 EDTA、尿素和去垢剂如0.5%SDS 或1%Triton X-100 存在时仍保留有酶活性，对于高分子量核酸的提取有很大的优势。 三、核酸的分离与纯化 （一）核酸分离纯化的基本方法 1. 酚抽提法 细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合液，混匀后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相，核酸则被留于上层水相。在含核酸的水相中加入醋酸钾或醋酸钠，形成核酸盐，核酸盐可被一些有机溶剂沉淀，离心得到的核酸可以用70%乙醇洗涤以除去多余的盐分，即可获得一定纯度的核酸。 2. 层析法 包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等。因分离和纯化同步进行，并且有商品试剂盒供应而被广泛应用于核酸的纯化。在一定的离子环境下，核酸可被选择性地吸附到硅土、硅胶或玻璃表面而与其他生物分子分离。 3.密度梯度离心法 双链 DNA、单链 DNA、RNA 和蛋白质具有不...
