病毒感染细胞实验整体流程及原理VIP专享

病毒感染细胞实验整体流程及原理 杨晓芳于 2011年 5月 11日整理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1 .1 慢病毒 1.1.1 原理 慢病毒（Lentiv iru s）是逆转录病毒的一种。构建的 siRNA / miRNA 慢病毒载体，与化学合成的 siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentiv iru s-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2 特点 1） 直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2） 可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3） 可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4） 无需任何转染试剂，操作简便。 5） 可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3 慢病毒包装简要流程： 1） 含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2） 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞 293T 等。 3） 培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4） 病毒的纯化和浓缩。 5） 分装、- 80 ℃保存。 6） 滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1 .2 、腺病毒 1.2.1 原理 腺病毒(Adenov iru s，Ad)是一种无包膜的线状双链 DNA 病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近 50 个血清型，大多数 Ad 载体都是基于血清型 2 和 5，通过转基因的方式取代 E1 和 E3 基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达 E1 和 E3 基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2 特点 1） 几乎可以感染所有类型的细胞 2） 可以获得复制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒 3） 病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到 1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4） 腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5） 感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3 腺病毒包装...