想做多重免疫荧光？收好指南，教你一张片子染出七种颜色想做多重免疫荧光？需要先思考这几个问题：问题 1：你认得全动物园里的动物们吗，比如大鼠，小鼠，兔，山羊，绵羊，鸡，荷兰猪(豚鼠)？不同种属的抗体需闹清楚。问题 2：你确定能分得清字母表并做得了十以内得加减法吗？有不同亚型鉴定的过的一抗，比如：IgGl,IgG2a，IgG2b，IgG2c，IgM，IgE 不知道怎能行？问题3：你确定能将动物和数字字母们对号入座，并找对门牌吗？有对应种属特异反应性的 Fab 二抗，比如：F(ab')2Fragment(避免 Fc 反应性出现的非特异染色)，Crossadsorbed(抗体纯化过程交叉吸附，避免物种交叉反应带来的背景)。问题 4：你确定能将重峦叠嶂移出两山排闼吗？选择合适的荧光素，明辨激发光和发射光，且不会导致荧光背景增强，比如：FITC、PE、Cy、AlexaFluor、DyLight。就算上面的问题你都能搞定，订购来了各种试剂，准备来了片子，你就一定能染出来多重颜色？你只是迈开了万里长征的第一步而已。因为要得到理想的荧光实验结果，每一个步骤都需深(wa)度(keng)优(mai)化(tu)，固定通透方法、浓度配比、抗体共孵育、抗体稀释液、封闭条件等等。此时，有人在你发际线还没有升高，头发还乌黑浓密的时候，在你的耳边悄悄跟你说：做多重荧光简单，有种快捷省时的方法。先让你们随意感受一下这种方法染出来的图片：接下来我们将仔细介绍该方法实验原理和实验步骤。多重荧光免疫组化（mIHC）实验原理上述方法采用 TSA 技术（TyramideSignalAmplification?，酪胺信号放大技术）：简单来说，用该方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的 HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在 HRP 和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后微波处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素还留存在样品上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最后去检测结果。由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。也就是说，如果用TSA 技术，同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。搭配同一支抗兔的 HRP 二抗就可以进行实验，而且信号放大的倍数大大增强。荧光法多重免疫组化，可同时进行五个颜色通道以上，这种情况下发射...
