慢病毒包装操作方案

慢病毒包装操作流程一、材料1 细胞培育试剂试剂名称终浓度试剂品牌DMEM/High glucose 基础培育基90%Invitrogen胎牛血清10%Invitrogen/Gibco丙酮酸钠1mMInvitrogenDMSO（冻存用）10%2 慢病毒包装试剂试剂名称浓度试剂品牌Lipofectamine 2000InvitrogenOpti-MEM 基础培育基InvitrogenPEG6000 溶液50%WakoNaCl 溶液40 mMHBSS 溶液Invitrogen3 耗材50 mL 离心管15 mL 离心管10 cm 细胞培育皿μm 过滤器2 mL EP 管二、操作流程1细胞培育1.1293T/293FT 细胞的复苏1)将完全培育液从 4°C 中取出放置到室温预热 30 min 左右。在超净台内，用吸管吸取 6~7mL完全培育液至 15 mL 离心管中；2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入 37°C 水浴中快速晃动（水不要没到盖子），使其在 1~2 分钟内完全融化；3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培育液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让 DMSO 分散，降低恢复室温的DMSO 对细胞造成的毒性作用）。4)在室温条件下，250 g 离心 4 分钟。5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取 2 mL 新奇完全培育液重悬细胞至单细胞悬液，再转移已经加好培育基的培育瓶/培育皿中，写上细胞名称、日期，放置 37°C、5% CO2饱和湿度培育箱内培育。（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的培育容器。）6)复苏翌日，给复苏的 293T 细胞更换新奇的完全培育基。1.2293T/293FT 细胞传代1)待细胞长至 60%-70%融合度即可传代。将培育瓶里的所有培育液全部移去，用 1×PBS 洗涤细胞两次（洗涤速度要快，避开细胞干涸时间过长），以去除残余的培育液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育 1-2 分钟。在显微镜下观察，可看到大部分细胞变圆不贴壁，拍打培育瓶两侧会有大量细胞脱离，此时应立即终止消化，若细胞仍然有大部分贴壁，可适当延长孵育时间；3)加入等体积完全培育液终止消化，并用吸管吹打培育瓶底 2-3 次使所有细胞彻底脱壁。用吸管转移细胞悬浮液到 15 mL 离心管中，用吸管吸取 2-3 mL 的 PBS 将残余细胞冲洗下来，一并加到 15mL 离心管中，混匀吹打 10 次使细胞分散；4)在室温条件下，250g 离心 4 分钟。离心后，倒去上清，用 2 mL 完全培育液重悬细胞，取样计数；...