体外转录RNA系统使用说明

实验操作过程胡建和共 6 页第 1 页 2022-4-28RiboMAXTMLargeScaleRNAProductionSystems-T7保存方法：避免反复冻融或者经常变换温度，以防影响产品稳定性。保存温度：-20°C试剂组成：ATP100 卩 lCTP100 卩 1GTP100 卩 1UTP100 卩 1RQ1RNase-FreeDNase110U 醋酸钠 3.0M(pH5.2)1m1T7 线性化对照 DNA10 卩 1 酶混合物，T7RNA 聚合酶 120 卩 1T75X 转录缓冲液 240 卩 1 无核酸酶水 1.25m1质量控制：32P 标记 RNA 除另外加入 5 卩 Cia-32PCTP400Ci/mmo1 之外，其它参照 TB166 所述方案进行。在这些条件下，经 TCA 沉淀计算，会有＞40 卩 g 的 RNA 合成。RNA 完整性：上述转录反应产物经凝胶电泳分析和放射自显影分析，最低标准应当有 90%的 RNA 按预期大小迁移成一条单一的带。I.概述体外转录反应广泛用于从重组 DNA 模板合成微克量的 RNA 探针。大多数用于生产 RNA 探针的转录反应多用于放射标记核糖核酸的合成，而不是合成大量的 RNA。但体外转录也用于需要大量具生物活性 RNA 的时候。大量的 RNA 产物可用于体外翻译、合成 tRNA 、 rRNA 或其它小的功能性RNA、RNA 病毒基因组和核酶，亦用于 RNA 拼接的底物、RNA 的二级结构、反义 RNA 以及 RNA-蛋白相互作用的研究。RiboMAXTMLargeScaleRNAProductionSystems 可产生微克量的 RNA，转录产物可达 14kb；但是,通常用于生产 5~6kb 的转录产物。RiboMAXTMSystems 在 1ml 反应体系中可稳定地合成 2~5mgRNA，大约比标准 Riboprobe®System 转录反应多 10~20 倍。RiboMAXTMSystems 不同于 Riboprobe®System 之处主要有三个基本方面：(1)使用 HEPES(pH7.5)缓冲液而不是 Tris-HC1(pH7.9)缓冲液，rNTP 和镁浓度调整到接近T7RNA 聚合酶活性浓度。⑵反应中添加了酵母无机焦磷酸酶 (pyrophosphatese)。⑶体系中含有rRNasein®RNA 酶抑制剂。RiboMAXTMSystems 另外的优点是，合成高质量的 RNA 可用于兔网状细胞翻译系统的体外翻译。增强的翻译能力尤其体现在高 RNA 浓度通常抑制体外翻译的时候。尽管影响 RNA产物的改良和翻译效率的原因还不太清楚，RiboMAXTMSystems 对希望合成大量用于体外翻译 RNA 的研究工作者来说是有用的。成分中对翻译抑制作用的减少，可能对其它需要应用生物活性 RNA 的工作来说，亦是极为有利的。因为 RiboMAXTMSystems 产生大量的 RNA,这些系统不推荐用于生产高特异活性的...