1。 T4DNA 连接酶：本酶催化相邻 DNA 链的 5’-P 末端和 3’-OH 末端以磷酸二酯键结合的反应，(将已有的两个 DNA 片段连接成为一条 DNA 链的酶，常用于基因工程，将目的基因连在质粒载体上，作用于两脱氧核糖核苷酸间的磷酸二脂键),需 ATP 作辅酶.本酶不仅可以催化粘性末端之间或平滑末端之间的 DNA 的连接，也可以催化 DNA 与 RNA 之间以及少数 RNA 之间的连接.T4DNA 连接酶可连接 DNA—DNA，DNA-RNA，RNA—RNA 和双链 DNA 粘性末端或平头末端。无论是T4DNA 连接酶，还是大肠杆菌 DNA 连接酶都不能催化两条游离的 DNA 链相连接。T4 DNA 连接酶常用于催化双链 DNA 平末端或互补粘性末端之间的连接反应，也能催化双链 RNA 5'-磷酸末端和 3’-羟基末端间的连接.还可以修复双链 DNA、RNA 或 DNA/RNA 杂交双链中的单链切口。以上反应均需消耗 ATP。粘末端的连接反应: 插入片段和载体的摩尔浓度比特别重要,此比例在 2—6 之间最好，低于 2:1 就会导致较低的连接效率，高于 6:1 则会导致多个插入.摩尔比请按载体与插入片段 DNA 浓度及分子大小来计算.平滑末端的连接反应:平滑末端的连接反应与突出末端相比反应较慢（其 Km 值约为突出末端的 100 倍）。进行平滑末端的连接反应时,可提高 DNA 浓度，将使用酶量增加到突出末端量的 2～5 倍左右。与粘粒或噬菌体进行连接反应:可使载体和插入 DNA 的摩尔比调整为 1：1,同时增大 DNA 浓度以便取得良好效果。 （0.05—0。1 μg／ul 以上).反应温度：该酶的最适温度为 37℃,由于热稳定性较差，因此长时间反应时通常需在 16℃下进行.若反应 1—2 小时左右的话也可在室温下进行反应。抑制剂:T4 DNA 连接酶要求 Mg 2+，因此螯合 Mg 2+的 EDTA 的存在会阻碍反应。将溶解于含有高浓度EDTA 缓冲液中的 DNA 准备作为样品使用时，最好先用灭菌蒸馏水或 TE 缓冲液进行置换.2. T4 DNA 聚合酶：T4DNAPolymerase,即 T4DNA 聚合酶,是一种模板依赖的 DNA 聚合酶,可以依赖于 DNA 模板对 5’端突出末端进行补平；同时可对 3'端突出末端进行削平.也可以在结合有引物的单链DNA 模 板 上 ， 从 5'→3’ 方 向 催 化 DNA 合 成 反 应 。 特 点 :T4DNAPolymerase 由 于 同 时 具 有5’→3’DNA 聚合酶活性和 3’→5’DNA 外切酶活性(但不具有 5’→3’外切酶活性），可以用于将 5'端突出末端补平、3...
