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Western Blot 实验报告正式实验客户姓名： 报告日期： 一、客户样品及抗体登记1．样品种属来源：2．样品标记：组织细胞样品名称备注3．抗体名称： 抗体来源： 抗体 Cat. 及 lot 号：二、材料和方法1．试剂及耗材蛋白抽提试剂（改进型 RIPA 配方）BCA 蛋白定量试剂盒2mg/ml BSA 标准品5×还原样品缓冲液10×Tris-Glycine-SDS 电泳缓冲液考马斯亮蓝染色液10×TBST pH8.0中分子量蛋白 marker（7 条带）中分子量预染蛋白 marker（7 条带）湿转缓冲液NC 膜，0.45um 孔径Millipore丽春红染色液BSAAmrescoPMSFAmresco蛋白酶抑制剂Roche磷酸酶抑制剂Roche脱脂奶粉伊利ECLMilliporeStripping buffer（抗体洗脱液）（抗体需要选择，选择后把多余的删除）山羊抗兔 IgG（H+L），HRPJackson山羊抗小鼠 IgG（H+L），HRPJackson兔抗山羊 IgG（H+L），HRPJacksonBeta-actin 兔多抗Beta-actin 鼠单抗Beta-tubulin 兔多抗Beta-tubulin 鼠单抗GAPDH 兔多抗GAPDH 鼠单抗2．实验仪器Fresco 低温冷冻离心机ThermoMultiSkan3 酶标仪ThermoMini P-4 电泳槽Cavoy湿转电泳槽Cavoy电泳仪Bio-Rad半干槽Bio-Rad水平脱色摇床其林贝尔酸度计 pH211Hanna电动组织匀浆器Fluka三、 实验方法及结果3.1 蛋白抽提3.1.1 组织蛋白抽提预冷 RIPA 蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂（磷酸化蛋白需要同时加入磷酸酶抑制剂）。在蛋白抽提开始前加入 0.1M PMSF 母液，PMSF 终浓度 1mM。称取组织重量以重量：裂解液体积=1:9 比例加入裂解液，用眼科剪剪碎组织块，Fluka 电动组织匀浆器 15000rpm 转速进行匀浆，每次10s，间隔 10s，进行三次匀浆。匀浆时 EP 管需要浸入冰水混合物中进行降温。匀浆完成后在冰上孵育 20min，4 度离心，13000rpm，20min。离心完成后取上清，分装保存，待测。3.1.2 细胞蛋白抽提预冷 RIPA 蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂（磷酸化蛋白需要同时加入磷酸酶抑制剂）。在蛋白抽提开始前加入 0.1M PMSF 母液，PMSF 终浓度 1mM。细胞计数，以细胞数量 1×107加入 1ml 裂解液，用枪头吹打充分悬起细胞，完成后在冰上孵育 20min，4 度离心，13000rpm，20min。离心完成后取上清，分装保存，待测。3.2 BCA 法蛋白定量准备 BCA 工作液 A 液：B 液=50:1，稀释好各个提取 BSA 标准品。样品用 PBS 进行稀释。样品： BCA 工作液 =1:8，混匀后 37 度孵育 30min 或者室温孵育60min，酶标仪 570...