叶酸的测定方法微生物法1.原理叶酸是酪乳酸杆菌（Lactobacilluscasei,L.C,ATCC7469）生长所必需的营养素。在一定条件下，L.C 的生长繁殖与培养基中叶酸含量呈正比关系，细菌增殖的量以光密度值计，通过与标准曲线相比较，计算出样品中叶酸的含量。2.适用范围参考《MethodsofVitaminAssay》，第 4 版。本方法适用于各类食物中叶酸的测定。检测限为O.lng。3.仪器与设备（1）恒温培养箱（2）离心机（3）高压消毒锅（4）震荡器（5）接种针和接种环（6）分光光度计4.试剂除特殊说明外，本实验中所有试剂均为分析纯，水为蒸馏水。（1）菌种：酪乳酸杆菌（Lactobacilluscasei,L.C,ATCC7469）（2）磷酸缓冲液（0.05mol/L,pH6.8）:称取 4.35gNa3PO4・12H2O,10.39gNa2HPO4・7H2O 溶解于 800ml 水中。临用前用约 5g 抗坏血酸调节 pH 至 6.8。（注：叶酸对光、热敏感，易被氧化破坏，抗坏血酸有助于保护叶酸被氧化。）（3）鸡胰酶溶液：称取 lOOmg 干燥的鸡胰酶（Difco 公司）（注：含有叶酸轭合酶，用于水解叶酸多谷氨酸盐），加入 20ml 磷酸缓冲液制成匀浆，3000rpm 离心 lOmin,取上清液备用。临用前现配。（4）蛋白酶-淀粉酶溶液：分别称取 200mg 蛋白酶（Sigma 公司）和淀粉酶（Sigma 公司），加入 20ml 磷酸缓冲液制成匀浆，离心 3000rpm10min,取上清液备用。临用前配制。（5）2+8 乙醇溶液：量取 20ml 无水乙醇溶液，加入 80ml 水混匀。（6）01mol/LNaOH:称取 0.4g 氢氧化钠，加 2+8 乙醇溶液溶解并稀释至 1L。（7）10mol/LNaOHo 称取 400g 氢氧化钠，加水溶解并稀释至 1L。（8）叶酸标准储备液（200mg/ml）:准确称取 200mg 叶酸标准品（Sigma 公司，纯度大于98%），用 O.Olmol/LNaOH 溶解并定容至 IL。储存于棕色瓶中。（9）叶酸标准中间液（200ng/ml）:准确吸取 1.0ml 叶酸标准储备液，用 0.01mol/LNaOH 溶解并定容至 1L。储存于棕色瓶中。待标定。标定：准确吸取 1ml 叶酸标准中间液，用 0.1mol/LNaOH 定容至 10ml。以 0.1mol/LNaOH 调零点，比色杯厚度 1cm,波长 256nm，测定 3 次紫外吸光度值，取平均值，按下式计算标准中间液浓度。公式（略）式中：X1--叶酸标准中间液浓度，ng/ml；A--标准中间液平均紫外吸光度值；E--摩尔消光系数 24,500；M--叶酸分子量 441.42；10--测定紫外吸光度值时的稀释倍数；106--由 g/L 换算成 ng/ml 的换算系数。（10）叶酸标准工作液（0.2ng/ml）...
