蛋白提取方法

1 材料和措施 ﻫ1.1 材料 １.1.１ 组织和细胞旳来源: 1.1.2 仪器设备 机械组织匀浆器 低温高速离心机 (>40，00 ０ g） ﻫ超速离心机 超生细胞破裂仪 ﻫ超纯水装置 ﻫﻫ１.1．3 试剂 三氯醋酸 （T Ｃ A） ﻫ丙酮 ﻫ二硫苏糖醇 (DTT) 尿素 CH Ａ PS PM Ｓ F EDTA ﻫ乙醇 磷酸 考马斯亮蓝 R3 ５０ 抑肽素 A 亮肽素 ﻫ试剂纯度均应是分析纯或以上。ﻫ1.1．4 溶液配制 (1） P ＢＳ: NaC ｌ ８ g, K Ｃ l 0.2 g, Ｎ a2HPO ４ 1．44 g, K Ｈ 2PO4,溶于 800 ｍ l 水中,用 HCl 调 pH 至７.４，用纯水定容至 1 L； (２) EDTA 储存液: 18．61 g Na ２ EDTA•2H2O,溶于 70 ｍｌ纯水中，用 1 ０ mo ｌ/L Ｎａ OH 调节 pH 值至８.0 (约需２ ｇ NaOH 颗粒)，定容为１ 00 m ｌ。可高压灭菌后分装备用； (３) 亮肽素储存液 (50 μg/ｍ l，100×) 10 mg/m ｌ溶于水,－75℃保存;使用时配成５０ μg/ml 储液，-20℃保存; ）ﻫ4（ 抑肽素储存液 (70 μg/ml,１ 00×） ﻫ１ mg/ml 溶于甲醇，-７５℃保存;使用时配成７ 0 μ ｇ/ｍｌ储液，－20℃保存; （5) PMSF 储存液 (10 mM, １ 00×）: ﻫ17.4 mg P Ｍ SF，溶于 1m ｌ异丙醇中,-20℃ 保存。 ﻫD Ｔ T 储存液 (１ M): ﻫ0.３1 ｇ DTT 溶于２ m ｌ H2O 中，-2 ０℃ 保存 (Ｄ TT 或具有 D Ｔ T 旳溶液不能进行高压解决,可过滤除菌)。 （7) 裂解液: Lysis buf ｆ e ｒ A ）ﻫ９ Ｍ ｕｒ e ａ, ４% ｗ/v CHA ＰＳ, 1% ｗ/ｖ Ｄ TT, 0.５% C Ａ a ｎ d ａ co ｃ kta ｉ l of p ｒ o ｔ ease in ｈi ｂｉ tor ｓ)ﻫﻫLysi ｓ buffer Bﻫ(7 Ｍ urea, 2 Ｍ th ｉ ou ｒ ea, 4% w／v Ｃ HAPS， １% w/v DTT, 0.5% CA a ｎ d a cocktaiｌ of protease i ｎ h ｉ b ｉ t ｏｒ s) Lys ｉｓ b ｕ f ｆ e ｒ Ｃ ﻫ40 mM Tr ｉｓ-ｂａ se (p Ｈ 9.5) in ultrａ pure H2OﻫLys ｉｓ buf ｆ e ｒ Ｄﻫ(8 M urea, 4% Ｃ H Ａ P Ｓ， 40 ｍ M Tris（ba ｓ e）， 40 ml)ﻫＬｙ si ｓ ｂｕ f ｆ er Ｅ ﻫ(5 M urea, 2 M th ｉ ou ｒ ea， 2% SB ３－10, 2% Ｃ HAPS, 1% w/v ＤＴＴ, 0.５% C Ａ and a cockt...