1 材料和措施 ﻫ1.1 材料 1.1.1 组织和细胞旳来源: 1.1.2 仪器设备 机械组织匀浆器 低温高速离心机 (>40,00 0 g) ﻫ超速离心机 超生细胞破裂仪 ﻫ超纯水装置 ﻫﻫ1.1.3 试剂 三氯醋酸 (T C A) ﻫ丙酮 ﻫ二硫苏糖醇 (DTT) 尿素 CH A PS PM S F EDTA ﻫ乙醇 磷酸 考马斯亮蓝 R3 50 抑肽素 A 亮肽素 ﻫ试剂纯度均应是分析纯或以上。ﻫ1.1.4 溶液配制 (1) P BS: NaC l 8 g, K C l 0.2 g, N a2HPO 4 1.44 g, K H 2PO4,溶于 800 m l 水中,用 HCl 调 pH 至7.4,用纯水定容至 1 L; (2) EDTA 储存液: 18.61 g Na 2 EDTA•2H2O,溶于 70 ml纯水中,用 1 0 mo l/L Na OH 调节 pH 值至8.0 (约需2 g NaOH 颗粒),定容为1 00 m l。可高压灭菌后分装备用; (3) 亮肽素储存液 (50 μg/m l,100×) 10 mg/m l溶于水,-75℃保存;使用时配成50 μg/ml 储液,-20℃保存; )ﻫ4( 抑肽素储存液 (70 μg/ml,1 00×) ﻫ1 mg/ml 溶于甲醇,-75℃保存;使用时配成7 0 μ g/ml储液,-20℃保存; (5) PMSF 储存液 (10 mM, 1 00×): ﻫ17.4 mg P M SF,溶于 1m l异丙醇中,-20℃ 保存。 ﻫD T T 储存液 (1 M): ﻫ0.31 g DTT 溶于2 m l H2O 中,-2 0℃ 保存 (D TT 或具有 D T T 旳溶液不能进行高压解决,可过滤除菌)。 (7) 裂解液: Lysis buf f e r A )ﻫ9 M ur e a, 4% w/v CHA PS, 1% w/v D TT, 0.5% C A a n d a co c kta i l of p r o t ease in hi bi tor s)ﻫﻫLysi s buffer Bﻫ(7 M urea, 2 M th i ou r ea, 4% w/v C HAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA a n d a cocktail of protease i n h i b i t or s) Lys is b u f f e r C ﻫ40 mM Tr is-ba se (p H 9.5) in ultra pure H2OﻫLys is buf f e r Dﻫ(8 M urea, 4% C H A P S, 40 m M Tris(ba s e), 40 ml)ﻫLy si s bu f f er E ﻫ(5 M urea, 2 M th i ou r ea, 2% SB 3-10, 2% C HAPS, 1% w/v DTT, 0.5% C A and a cockt...