实验七 蛋白质含量测定 测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲(Biuret)法，酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。[目的要求]1．掌握测定蛋白质的含量基本方法。2．了解染料法、双缩脲法、Lowry 法和紫外吸收法测定原理。 一、染料法[实验原理]在酸性溶液中染料考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝 G-250 颜色从红色变为蓝色，吸收高峰从 460nm 移至 595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。该法近年在某些方面有取代经典的 Lowry 法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。[器材] 吸量管； 试管；721 型分光光度计[试剂]1.标准牛血清白蛋白溶液：配成 0.1mg/ml 的溶液。2.待测蛋白质溶液。3.染料溶液：称取考马斯亮蓝 G-250 0.1g 溶于 95%的酒精 50ml，再加入85%的浓磷酸 100ml，用水稀释至 1000ml,混匀备用。[操作步骤]1． 标准曲线的绘制：试剂(ml)\管号012345标准蛋白溶液00.20.40.60.81.0H2O1.00.80.60.40.20染料溶液5.05.05.05.05.05.0A595nm 按上表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min 后在 595nm 波长处以 0 号管调零,测定各管吸光度值（A）。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。2．样品测定：取 1ml 样品溶液（约含 25～250 微克蛋白质），加入染料溶液 5ml 混匀，5min 后测定其 595nm 吸光度值，对比标准曲线求得蛋白质浓度。 二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量 [实验原理]在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[—如CH2-NH2—，CS-NH2—，C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定范围为 1～10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快...
