蛋白酶活性的测定

实验四 蛋白酶活力的测定一、实验目的 1、了解蛋白酶活力测定的原理； 2、掌握蛋白酶活力测定的方法。 二、实验原理蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。在 280nm 波长下测定溶液吸光度的增加，就可计算酶的活力。 三、实验试剂① 微生物蛋白酶萃取液（0.01g/ml）：称取 1.0g 酶制剂，加 100ml 蒸馏水搅拌30min，在 4℃下离心分离后，将上层清夜置于冰箱中保存，使用前稀释一定倍数；② 0.02mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.5）；③ 1%酪蛋白溶液：取 1.0g 酪蛋白，加 100ml 0.2mol/L 磷酸盐缓冲液（PH7.5），加热并搅拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存；④ 5%三氯醋酸（TCA）溶液。四、实验步骤1、将 5%TCA 溶液和 1%酪蛋白溶液在 37℃下保温。2、取四支 15ml 具塞试管，分别标上记号 A1、A0、B1 和 B0。在 A1 和 A0 试管中各吸入 0.20ml 酶液，在 B1 和 B0 试管中各吸入 0.40ml 酶液，分别用0.2mol/L 磷酸盐缓冲液定容至 2.00ml。在 A0 和 B0 试管中各吸入 6.00ml5%三氯醋酸溶液，上述四支试管都置于 37℃水浴中保温。3、在各试管中吸入 2.00ml 1%酪蛋白溶液，在 37℃下保温 10min（准确计时）后，再向 A1 和 B1 试管中吸入 6.00ml5%三氯醋酸溶液。4、将试管从水浴中取出，在室温下放置 1h，用少量上清液润湿滤纸后过滤，保留滤出液。5、在 280nm 波长下，分别以 A0 和 B0 滤液为空白，测定 A1 和 B1 滤液的吸光度。 五、计算 1、在规定的实验条件下，以每分钟增加 0.001 吸光度定义为一个酶单位。 2、每克酶制剂中酶活力的计算： ∆A × 1000 / (t × w) 酶活力单位/克酶制剂 ∆式中， A——样品与空白吸光度差值（即 A1 和 B1 的吸光值）； t —— 酶作用时间（本实验为 10min）；w——反应中酶的用量，g 六、说明 1、微生物蛋白酶粗提取液在较宽广的 PH 范围表现出活力，但是在接近中性条件下最有最高活力。 2、微生物蛋白...