蛋白质印迹实验方案

蛋白质印迹（Western blot）实验方案溶液和试剂裂解缓冲液这些缓冲液可在 4 ℃ 下保存数周，或者以分装形式在 -20 ℃ 下保存长达 1 年。Nonidet-P40 (NP40) 缓冲液150 mM NaCl1.0% NP40（可用 0.1% Triton X-100 替代）50 mM Tris-HCl pH 8.0蛋白酶抑制剂RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀试验缓冲液）150 mM NaCl1.0% NP-40 或 0.1% Triton X-1000.5% 脱氧胆酸钠0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）50 mM Tris-HCl pH 8.0蛋白酶抑制剂Tris-HCl 缓冲液20 mM Tris-HCl pH 7.5蛋白酶抑制剂电泳、转膜、封闭缓冲液Laemmli 2× 缓冲液/上样缓冲液4% SDS10% 2-巯基乙醇20% 甘油0.004% 溴酚蓝0.125 M Tris-HCl测定 pH 并调节至 pH 6.8。电泳缓冲液（Tris-甘氨酸/SDS）25 mM Tris 碱190 mM 甘氨酸0.1% SDS测定 pH，pH 应为约 8.3。必要时进行调节。转膜缓冲液（湿转）25 mM Tris 碱190 mM 甘氨酸20% 甲醇测定 pH，pH 应为约 8.3。必要时进行调节。对于大于 80 kDa 的蛋白质，我们推举加入最终浓度为 0.1% 的 SDS。转膜缓冲液（半干转）48 mM Tris39 mM 甘氨酸20% 甲醇0.04% SDS封闭缓冲液5% 奶粉或 BSA（牛血清白蛋白）加入 TBST 缓冲液中。混匀并过滤。过滤失败可能导致出现“斑点”，其中微小的黑色颗粒会在显色过程中污染印迹。实验步骤样品裂解1. 制备细胞培育物裂解物.将细胞培育皿置于冰上，用冰冷的 PBS 洗涤细胞。.吸 出 PBS ， 然 后 加 入 冰 冷 的 裂 解 缓 冲 液 （ 每 107 细 胞 /100 mm 培 育皿/150 cm2 培育瓶加入 1 ml；每 5×106 细胞/60 mm 培育皿/75 cm2 培育瓶加入 0.5 ml）。.用预冷的塑料细胞刮棒刮下贴壁细胞，然后轻轻地将细胞悬浮液转移至预冷的微量离心管中。.在 4 ℃ 下持续搅拌 30 分钟。.在 4 ℃ 预冷的离心机中以 16,000 × g 的转速离心 20 分钟。.轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中，弃去沉淀。2. 制备组织裂解物.用洁净的工具切取目标组织，此操作最好在冰上进行，并且应尽快完成，以防止样品被蛋白酶降解。.将组织置于圆底微量离心管或 Eppendorf 管中，并浸入液氮中进行“速冻”。将样品保存在 -80 ℃ 下以备后续使用，或放置在冰上直接进行匀浆。对于约 5 mg 的组织，向离心管中快速加入约 300 μL 裂解缓冲液，然后用电动匀...