园艺学实验技术思考题及答案(6 页)Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。1、请阐明 PCR 的原理和引物设计的注意事项原理：PCR 技术的基本原理 类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 93℃左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板 DNA 与引物的退火(复性)：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至 55℃左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4 分钟， 2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍注意事项：①引物长度：15-30bp，常用 20bp 左右；②引物扩增跨度：以200-500bp 为宜，特定条件下可扩增至 10kb 的片段；③引物碱基：G+C 含量为 40-60%为宜，ATGC 最好随机分布，避开 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸成串排列；④避开引物内部出现二级结构，避开两条引物间互补，特别是 3’端互补；⑤引物 3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基应严格要求配对；⑥引物中最好有合适的酶切位点；⑦引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性；⑧序列 Tm 为 55-60℃，尽可能与上下游引物的 Tm 值一致，不超过2℃2、试述 Southern 技术的原理，操作和注意事项原理：将待检测的 DNA 分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的 DNA 或 RNA 探针进行反应。假如待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。操作：①基因组酶切；②用琼脂糖凝胶电泳队 DNA 片段按分子量大小分离；③将 DNA 片段在琼脂糖凝胶电泳变性成单链后，再转移到适当的故乡支持物上并与之结合（即转膜）；④探针与膜上 D...
