小麦萌发前后淀粉酶活力的比较

小麦萌发前后淀粉酶活力的比较(4 页)Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。小麦萌发前后淀粉酶活力的比较及电泳法测定蛋白含量 一.实验目的1.掌握利用光照培育箱培育小麦的方法；2.了解酶的制备及活力测定的一般原理与方法；3.掌握淀粉酶的活力测定技术，了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化；4.巩固对 721 或 722S 型分光光度计和离心机的熟练使用；5.灵活运用 3，5-二硝基水杨酸比色法测定样品中还原糖含量的原理和方法；6.掌握 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺电泳法；二.实验原理种子中的碳水化合物主要是以淀粉的形式存在。淀粉酶是一种水解酶，它能使淀粉水解为麦芽糖，催化反应为：2（C6H10O5）+n H2O------n C12H22O11麦芽糖具有还原性，与 3，5-二硝基水杨酸在供热的条件下生成棕色的 3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，棕色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比，因此可利用比色法测定还原糖的量。休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌发后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数的增长而增加。三.实验步骤1.种子发芽小麦种子浸泡 2.5h 后，放入 25℃恒温箱内发芽。2.酶液提取取发芽第三天或者第四天的幼苗 8 株，放入研钵中，加入石英砂少许，加入PH6.8 磷酸盐缓冲液 10ml，研磨至匀浆状。在室温下静置 20min，搅拌几次。提取液 1500rpm 离心 7min。上清倒入量筒，测定酶提取液总体积，并将酶液稀释 10 倍。取干燥种子或者浸泡 2.5h 后的种子 8 粒作为对比，步骤同上。3.SDS-PAGE 聚丙烯酰胺电泳法测定蛋白条带。4.酶活力的测定（1）取大试管 6 支，根据下表加入各试剂（1）取大试管 6 支，根据下表加入各试剂空白标准 萌发前 萌发后123456酶液（ml）0.50.50.50.50.1%麦芽糖（ml）0.51%淀粉（ml）111111水（ml）0.5将各试管摇匀，放入 37 水浴锅中保温 3min，立即向各试管中加入 DNS 试剂2ml。（2）取出各管，放入沸水浴中加热 5min，流水冷却至室温，加水稀释至25mL，充分混匀后 1:1 稀释。用空白管做对比，在 520nm 处测定各管 OD 值，并对 3 和 4、5 和 6 管分别取平均值作为萌发前和萌发后的 OD 值。四.计算 根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即 A 标准/A 未知=C 标准/C 未知 可推导出 C 酶液=A 酶液/A 标准×C 标准8 粒的总活力=C 酶×n 酶×V 酶A 为光吸收值；C 酶=酶液管的麦芽糖浓度;n 酶=酶液稀释倍数;V 酶=提取酶液总体积。...