蛋白提取步骤

提蛋白及 WB 得步骤整个过程细胞或蛋白都必须放冰上准备工作：前一天准备:借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂就是否充足、当天准备:洗玻璃板、开紫外，冰块、碎冰、标记 1、5 ｍ l 离心管及 0、6ml离心管、细胞刮板、开低温高速离心机细胞裂解液配制:1ml c ｅ ll lys ｉ s10ul NP-40（离心机后)25u ｌ 焦磷酸钠４ 0u ｌ NaF１ ul β-甘油磷酸2 ul Na3VO41ul 蛋白酶抑制剂（用完即放回冰箱)１ 0ul P Ｍ SF(最后加，随加随用,有毒）细胞裂解与收集1. 观察细胞状态,并准备提蛋白：吸走培育基、用ＰＢ S 洗细胞两次(倾斜贴壁加 PB Ｓ，左右轻轻摇)，倾斜贴壁吸走ＰＢ S。2. 将细胞盘拿到外间冰上，加裂解液（体积网上推举:一般 1 ０ 6加 0、1m ｌ ），冰上静置1-2 ｍｉ n。3. 刮细胞:细胞刮板每次用之前拿水涮一涮,甩干,然后从中间到外面打圈刮,再从下往上,从上往下全面刮，(刮得时候要迅速），最后用枪吸取裂解液至离心管.细胞破裂4. 超声波破裂细胞：准备三个小烧杯，加满冰块,三个小夹子。(超声波破裂仪得铁棒不要碰到离心管得壁与底部）超声波设置:工作功率 5％ 工作时间 3min 开机时间 15 ｓ,关机时间３０ s 温度０度,报警温度 1 度5. ４℃、1300 ０ｒ／ｍ in,离心 15min。(离心机用后一直保持打开得状态,）蛋白保存6. 蛋白保存及分装:吸上清液至０、6ml 离心管,涡旋、吸一半至另一个管中,涡旋。—80℃保存。注意事项：P Ｍ SF 一定要现用现加,PMSF 在水溶液中不稳定,30 ｍ in 内就会降解一半.样品处理超过 1 ｈ，补加一次。BCA 测定蛋白浓度1、测空白板，选差异较小得孔。BCA 测定法波长 570,B ｒ acf ｏ rd:5952、标准蛋白得稀释(5mg/u ｌ):分装 1ml PB Ｓ来使用,稀释标准蛋白至０、5mg/ul。取 5u ｌ标准蛋白＋45ul PBS3、加样:浓度00、10、20、３0、4BS Ａ（ul)0481216PBS(ul)2016１ 2844、样品蛋白稀释 20 倍:２ｕ l 蛋白+18u ｌ PB Ｓ5、配 BCA：每个孔２００ ul，一个样品 2 个重复，Ａ:B=５ 0：１，根据样品数来计算BCA 得用量，一般防止损耗,多算一个样。6、加 B ＣＡ:悬空加、37℃孵育 3 ０ m ｉ n。(手不能碰板得底部，影响测定结果）7、计时３ 0mi ｎ8、配分离胶，灌胶，加水封。9、计时２ 0 ｍ i ｎ．10、测蛋白：先振板、再设置参数.11、计算上样体积：12、配浓缩胶,灌胶,加梳子，等 1－2 ｍｉ n，出现缩胶得地方...