山西农业大学大学生科技创新项目管理合同书（项目编号：9-031）项目名称欧李PSY基因克隆、表达和功能研究项目负责人_____________________承担单位_____________园艺学院____________________起止时间_________2011.5—2012・4_______________填报日期2011年05月30日一、项目研究内容：1欧李PSY基因全长分离根据GeneBank中已登录的PSY基因序列，设计简并引物，利用同源序列法分离欧李果实PSY基因片段，再通过3’-RACE和5’RACE技术克隆欧李PSY基因3’-末端序列和5’-末端序列，最后进行相关序列的拼接、组装和分析，获取欧李果实PSYcDNA全长序列；2欧李PSY基因生物信息分析利用生物信息工具和软件对分离的PSY基因进行生物信息学研究与分析，包括开放读码框分析、序列同源性比较、氨基酸疏水性分析、蛋白质跨膜预测、信号肽序列分析、分子进化树构建等；3欧李?，丫基因表达特性分析根据获得的PSYcDNA全长序列，设计特异引物，利用实时荧光定量RT-PCR分析PSY在欧李果实不同发育时期的表达特性，建立欧李果实发育过程中PSY基因的表达谱，探索欧李PSY基因在欧李果实类胡萝卜素合成和积累过程的转录调控规律；4欧李PSY基因在大肠杆菌中的功能表达根据获得的欧李PSYcDNA序列设计特异引物扩增欧李PSY开放读码框序列，将其克隆全原核表达载体pET-28a(+)，构建原核表达质粒pET-PSY；进一步将pET-PSY转入可合成和积累GGPP的工程大肠杆菌中诱导表达，利用高效液相色谱(HPLC)分析工程大肠杆菌中类胡萝卜素的合成和积累，从而对欧李PSY的功能特性进行分析和鉴定。二、总体方案及拟采用的研究方法和技术路线：1总体方案项目拟以我国特有果树欧李为研究对象，利用RACE技术分离欧李果实类胡萝卜素合成关键酶基因psy，进一步通过现代生物信息学分析、实时定量RT-PCR技术及工程大肠杆菌异源表达体系等，对欧李psy基因的转录特性及功能特征进行研究，以期为欧李果实类胡萝卜素合成和积累的机制提供依据，也为今后改良欧李果实色泽和提高欧李果实营养品质奠定基础。2研究方法2.1试验材料收集试材选用山西农业大学园艺研究所选育的欧李(Cerasushumilis(Bge)Sok)优良品种‘农大4号’，从果实未成熟至完全成熟共分5个发育时期采集。样品采集后迅速将果肉分离，液氮冷冻后置于-80°C保存备用；2.2总RNA提取和cDNA合成采用TRIzol法提取果实总RNA，经DNaseI37C处理1h以去除DNA污染。利用RevertAidTM-MuLV试剂盒(MBILithuania)将处理后的RNA反转录合成第一链cDNA，具体参照试剂盒的操作说明书进行；2.3PSY基因全长cDNA序列分离技术根据GeneBank已登录的PSY基因保守序列区设计简并引物，以上述欧李果实cDNA为模板，利用RT-PCR技术扩增获得欧李PSY基因cDNA片段；通过RACE技术（RapidamplificationcDNAends）技术获得欧李PSY基因cDNA5’和3’末端序列，拼接欧李PSY基因的全长cDNA序列，具体操作参照FirstChoiceTMRLM-RACEkits（Ambion,USA）说明进行；2.4实时荧光定量RT-PCR分析基因表达根据上述获得的欧李PSY基因cDNA序列，设计特异引物，利用7500实时荧光定量PCR仪（ABI，USA）分析欧李PSY基因在果实不同发育时期的表达特性；具体的操作参照Liu等（2007）的方法进行；2.5欧李PSY基因在工程大肠杆菌体系中功能表达根据已获得欧李PSY基因cDNA全长序列，设计特异引物扩增其开放读码框序列，克隆到大肠杆菌原核表达载体pET-28a（+），获得原核表达重组质粒pET-PSY。将重组质粒pET-PSY转入可合成和积累GGPP的大肠杆菌工程菌株中诱导表达，根据大肠杆菌工程菌株颜色的变化或HPLC测定类胡萝卜素含量和组分的变化来鉴定欧李PSY蛋白的功能特性，具体的操作参照Cunningham等（1996）和Jayarai等（2007）的方法进行。3技术路线项目拟采取的技术路线如图所示。姓名性别出生年月班级电话承担任务男1991.03对整个项目的实施男1992.01欧李PSY基因全长分离女1989.06欧李PSY生物信息学分析男1989.06欧李PSY基因表达特性分析男1992.081欧李PSY基因在大肠杆菌中功能表达五、指导教师基本情况：项目负责人姓名性别男出生年月1974.04学位研究生学历博士从事专业职称副教授住址山西农业大学家属院毕业时间2009.12毕业学校华中农业大学...
