影响 PC Ｒ得主要因素PCR 技术必须有人工合成得合理引物与提取得样品 DN Ａ,然后才进行自动热循环,最后进行产物鉴定与分析、引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强得讨论院、所进行,临床应用只需购买ＰＣ R 检测试剂盒就可开展工作,PＣ R 自动热循环中影响因素很多,对不同得ＤＮ A 样品,ＰＣＲ反应中各种成份加入量与温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下、 一、温度循环参数 在 PCR 自动热循环中,最关键得因素就是变性与退火得温度、如操作范例所示,其变性、退火、延伸得条件就是:9 ４℃60 ｓ, 37℃6 ０ s, 72℃１ 20s,共 25~30 个循环,扩增片段 50 ０ bp、在这里,每一步得时间应从反应混合液达到所要求得温度后开始计算、在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度得时间需要 30~60s,这一迟滞时间得长短取决于几个因素,包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源(水浴或加热块)以及两步骤间得温度差,在设置热循环时应充分给以重视与考虑,对每一仪器均应进行实测。 关于热循环时间得另一个重要考虑就是两条引物之间得距离;距离越远,合成靶序列全长所需得时间也越长,前文给出得反应时间就是按最适于合成长度 5 ００ bp 得靶序列拟定得。下面就各种温度得选择作一介绍、 1、模板变性温度变性温度就是决定 P ＣＲ反应中双链 DNA 解链得温度,达不到变性温度就不会产生单链 DNA 模板,PCR 也就不会启动。变性温度低则变性不完全,DNA 双链会很快复性,因而减少产量。一般取 9 ０~９ 5℃。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA 变性只需要几秒种,时间过久没有必要;反之,在高温时间应尽量缩短,以保持 Taq DNA 聚合酶得活力,加入Ｔ aq DN Ａ聚合酶后最高变性温度不宜超过 95℃。 ２、引物退火温度退火温度决定 PC Ｒ特异性与产量;温度高特异性强,但过高则引物不能与模板牢固结合,D Ｎ A扩增效率下降;温度低产量高,但过低可造成引物与模板错配,非特异性产物增加。一般先由３ 7℃反应条件开始,设置一系列对比反应,以确定某一特定反应得最适退火温度。也可根据引物得(G＋C)%含量进行推测,把握试验得起始点,一般试验中退火温度Ｔ a(annea ｌ ing tem ｐ e ｒ ature)比扩增引物得融解温度 TTm(mel ｔ i ｎ g ｔ empe ｒature)低５℃,可按公式进行计算:Ta = T ｍ — 5℃＝ ４(G+Ｃ)+ ２(A+T) —５℃ 其中Ａ,T,Ｇ,C 分别表示相应碱基得个数...
