蛋白质含量测定方法汇总

实验七 蛋白质含量测定 测定蛋白质得定量方法有很多,目前常用得有染料法,双缩脲(Biuret)法,酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。[目得要求]1.掌握测定蛋白质得含量基本方法。2.了解染料法、双缩脲法、Lowry 法与紫外吸收法测定原理。 一、染料法[实验原理]在酸性溶液中染料考马斯亮蓝 G250 与蛋白质结合,此时考马斯亮蓝 G250 颜色从红色变为蓝色,吸收高峰从 460nm 移至 595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。该法近年在某些方面有取代经典得 Lowry 法趋势,因为它操作简单,反应时间短,染料蛋白质颜色稳定,抗干扰性强。本法得缺点就是:对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异得蛋白质,有一定误差,因为不同得蛋白质与染料得结合就是不同得,故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近得蛋白质。[器材]吸量管; 试管;721 型分光光度计[试剂]1、标准牛血清白蛋白溶液:配成 0、1mg/ml 得溶液。2、待测蛋白质溶液。3、染料溶液:称取考马斯亮蓝 G250 0、1g 溶于 95%得酒精 50ml,再加入 85%得浓磷酸100ml,用水稀释至 1000ml,混匀备用。[操作步骤]1. 标准曲线得绘制:试剂(ml)\管号012345标准蛋白溶液00、20、40、60、81、0H2O1、00、80、60、40、20染料溶液5、05、05、05、05、05、0A595nm 按上表分别向各支试管内加入各种试剂,充分混匀,5min 后在 595nm 波长处以 0 号管调零,测定各管吸光度值(A)。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。2.样品测定:取 1ml 样品溶液(约含 25～250 微克蛋白质),加入染料溶液 5ml 混匀,5min 后测定其595nm 吸光度值,对比标准曲线求得蛋白质浓度。 二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量 [实验原理]在碱性溶液中,双缩脲(H2NCONHCONH2)与二价铜离子作用形成紫红色得络合物,这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CONH2),或与此相似得基团[如—CH2NH2,—CSNH2,—C(NH)NH2]得任何化合物,无论这类基团直接相连还就是通过一个碳或氮原子间接相连,均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CONH—),可发生双缩脲反应,且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比,可用比色法测定蛋白含量。测定范围为 1～10mg 蛋白质。干扰这一测定得物质主要有:硫酸铵、Tris 缓冲液与某些氨基酸等。此法得优点就是较快速,不同得蛋白质产生颜色得深浅相近,以及干扰物质少。主要得缺点就是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速,但并不需要十分精确得蛋白质测定...