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IPCR确定T-DNA突变体插入位点---副本

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激活标签突变体的筛选(1)将激活标签农杆菌转化后收获的种子播种在营养培育土中。(2)待苗出齐后(8-10 天左右),喷施体积比 1:1000 水稀释的除草剂(商品名为 Finale.,有效成份为 5.78 % Glufosinate-ammonium ),每 7 天喷施 2 次,连续21 天,筛选对除草剂有抗性的转化植株(transformants )。(3)将表型有明显变化的转化植株编号拍照,并单株采收。IPCR 确定 T-DNA 突变体插入位点IPCR 是克隆插入片段侧翼序列非常有效的方法。IPCR 可用于讨论与已知 DNA 区段相连接的未知染色体序列,这时选择的引物虽然与核心 DNA 区两末端序列互补,但两引物 3’端是相互反向的,其目的在于扩增一段已知序列旁侧的 DNA。先提取筛选后得到的 T-DNA插入突变体植物基因组 DNA,选择 T-DNA 插入标签中没有的限制性内切酶位点,用限制性内切酶对基因组 DNA 进行酶切消化,回收DNA,T4DNA 连接酶连接酶切产物成一个环状 DNA 分子,采纳IPCR 引物以回收的环状 DNA 分子为模板进行 PCR. PCR 反应体系不是在引物之间而是在引物外侧合成 DNA,使链的延长经过环上的未知区。因此这种方法可用于扩增木来就在核心区旁边的序列。

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