超级感受态细胞的制备

超级感受态细胞的制备1.第一天晚上，将置于液氮中保存的大肠杆菌（DH5α）画线在 LB 平板上，37℃倒置培育活化（一般需 12-16h 也就是过夜即可，时间过长易有杂菌的微克隆）。2.第二天早上，距前一天晚上约 13 个小时将划线的平板从 37 度拿出 4 度放置，晚上挑取一个经 37℃培育过夜活化的单菌落（2-3mm 直径），接种至试管中的 3mlSOB 培育液中， 200 转过夜培育 12-16h；3.第三天早上，将上述培育物接种于三个盛有 100ml 的 SOB 培育液的 250ml 锥形瓶中；4.培育约 2 小时后，测量培育物的 OD 值，以后每 45min 测定一次；5.当培育物的 OD 值达到 0.6-0.7 时，将培育瓶置于冰上 10min；6.（提前预冷离心机，可将 50mL 离心管以及 TB 缓冲液放入制冰机中预冷）将 100ml 菌液分装到四个 50mL 离心管中，4℃，4000rpm 离心 10min；7.倒去培育液，将离心管倒扣在吸水纸上 2min 以吸干剩余液体；8.用 4mlTB 缓冲液分别将 4 个离心管的沉淀悬浮，并至一个离心管加至 30ml 预冷的 TB缓冲液，将细胞混匀（菌比较脆弱！动作要轻。可将 TB 缓冲液打到离心管壁上让其自动流下）；9.于 4 ,4000rpm℃离心 10min 收集菌体；10. 倒去上层培育液，将离心管倒扣在吸水纸上 2min 以吸干剩余液体；11. 用 4ml（第一次做可以先少加一点缓冲液重悬，若感觉效率挺高以后再做可以适当多加一点缓冲液，动作要轻）预冷的 TB 缓冲液轻轻重悬沉淀；12. 加适量 DMSO 至终浓度 7％（没有找到 DMSO 我用甘油代替，甘油终浓度为 15％）。轻轻混匀细菌悬夜，放置冰上 10min；13. 迅速将悬夜分装到冷却的离心 1.5ml 离心管中（100μl/管 ），投入液氮中快速冷冻细胞，（我们没有用液氮，分装完直接放-70℃，不过用一下液氮效果会好点）贮存于-70℃备用。注：1.需要提前配制的培育基：SOB 培育基（100ml 液体）：Trpton：2gyeast extract 0.5gNaCl 0.05g250mM KCl 1ml（预先配好）高压蒸汽 121℃灭菌 30min 使用之前加入 0.5ml 2mol/LMgCL2（预先配好）相应固体培育基加入适量琼脂即可SOC 培育基（100ml）：100ml SOB ＋ 1mol/L 的葡萄糖 2ml 配成 SOC。(葡萄糖在培育基终浓度为 20mM)2.配培育基需提前配制的溶液：250mM KCl 将 1.86gKCL 溶入 90mlH20,定容至 100ml 可直接加入培育基与其一起灭菌2mol/LMgCL2 19gMgCL2 溶于 90mlH20,定溶至 100ml 单独高温灭菌 ...