平台简介：以家蚕作为生物反应器，利用分子生物学手段，构建了系统的家蚕杆状病毒高效表达药用外源蛋白体系，建立了全方位的具有自主知识产权的生物医药产业化平台。我们在国际上首次克隆家蚕杆状病毒（BmNPV）的P10基因并证明P10启动子也是强启动子，具备作为表达载体启动子的功能特征，首次利用BmNPVP10启动子在家蚕细胞中表达了氯霉素乙酰基转移酶。成功构建重组可救活线性化家蚕核多角体病毒基因工程载体，筛选效率提高1000倍，时间缩短10倍；成功构建半胱氨酸蛋白缺失型家蚕核多角体病毒基因工程载体，表达效率提高40%。通过构建一系列的新型重组病毒和表达载体，形成全新的家蚕生物反应器技术平台。此后，以家蚕生物反应器技术平台生产口服疫苗和药物为研究特色，建立了家蚕生物反应器生物制药技术平台和家蚕功能基因组研究技术平台，主要致力于应用基因工程技术和生化下游技术制备药物及疫苗，探索基因工程药物（疫苗）口服途径及其产业化，同时开展家蚕功能基因组学的研究，探索家蚕生长发育中的基因调控机制。在国内外学术刊物上发表研究论文170余篇，其中被SCI收录40余篇，编写专著6本；完成科研项目26项，其中国家级13项，省部级10项，在研项目4项；获得国家发明专利14项，公开国家发明专利5项；在国际学术刊物上发表研究论文37篇；申请国家发明专利17项，获得国家发明专利7项。在家蚕生物反应器生产口服药物和疫苗的研究、家蚕功能基因组学和蛋白质组学以及家蚕RNA相关研究中都取得了新的突破。平台具体内容、研究成果：一、家蚕生物反应器生产口服蛋白质药物技术平台体系的构建通过一系列的新型基因工程载体的构建，成功建立家蚕生物反应器蛋白表达技术平台。家蚕生物反应器表达的产物经证实可以直接用于口服药物的开发，目前已经证明家蚕表达生产的药物由于有蚕血淋巴本身的大量蛋白的保护作用和一些未知的机理，直接经口服给药而进入血液循环。这类药物既可以免去药物的分离纯化过程，又可解除病人注射的痛苦和被感染的危险。(1)家蚕生物反应器蛋白高效表达技术平台的构建国际上首次克隆并测序家蚕杆状病毒（BmNPV）的P10基因（GenBank登录号为S76783），并证明P10启动子也是强启动子，具备作为表达载体启动子的功能特征，此后，首次利用P10启动子在家蚕细胞中表达了氯霉素乙酰基转移酶；通过野生型家蚕核多角体病毒中国镇江株BmNPVZJ8基因组与修饰型苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒AcNPVBacPAK6基因组在家蚕细胞内同源重组，构建成重组救活可线性化修饰型家蚕核多角体病毒基因工程载体BmBacPAK6。BmBacPAK6含有LacZ基因和两个Bsu36I酶切位点用于线性化。BmBacPAK6用作外源基因表达重组救活病毒筛出率几近100％。BmBacPAK6用作载体表达人EPO基因，感染家蚕虫体和家蚕蛹时，EPO表达量达7.4×104U/ml血淋巴；在此基础上，成功构建半胱氨酸蛋白酶缺失型BmNPV基因工程载体，通过一种半胱氨酸蛋白酶基因缺失型家蚕核多角体病毒BmZJCP基因组DNA和构建的转移载体pCP-GFP与上述BmBacPAK6共转染家蚕细胞，经细胞内同源重组获得。此半胱氨酸蛋白酶缺失型病毒感染的家蚕细胞中，外源基因表达量比对照高约40％，宿主存活期及产物高表达期延长，从而提高总表达量。通过构建一系列的新型重组病毒和新型表达载体，形成全新的家蚕生物反应器蛋白高效表达技术平台。(2)口服有效的rhGM-CSF蛋白药物的制备及其生白效果至今，有很多的外源蛋白在家蚕细胞和幼虫中得到表达，但作为生物反应器，家蚕蛹可能更加适合表达外源目的基因。我们通过重组家蚕杆状病毒在家蚕蛹中成功表达了人粒细胞-巨细胞激落刺激因子（hGM-CSF）。表达的重组蛋白rhGM-CSF分子量为29kDa，等电点5.1，脱糖基化分析表明和大肠杆菌表达rhGM-CSF相比，家蚕蛹表达rhGM-CSF经过了糖基化后修饰，同时还可能经过了其他的翻译后修饰。重组家蚕蛹蛋白粗提物中rhGM-CSF比活达到6.8×106cfumg-1，经纯化我们得到比活大于8.4×106cfumg-1的重组蛋白。本研究表明家蚕蛹能够作为一种方便的低成本的生物反应器用于外源基因的表达。相关研究成果发表在J.Biotechnol.上。我们通过家蚕蛹生物反应器高效表达了rhGM-CSF，为了进一步研究家蚕蛹...
