重组人B淋巴细胞刺激因子工程菌高密度发酵VIP专享VIP免费

第1页共6页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第1页共6页HighCellDensityFermentationofRecombinantHumanBLymphocyteStimulatorXueXiao-Chang,BaoChun-Jie,HanWei,QinXin,ZhangCun,CaoZhu-Rong,LiWei-Na,ZhaoYu-Hong,ZhangYingqiBiotechnologyCenterofFourthMilitaryMedicalUniversity,Xian710032Abstract:InordertoreachthegoalofhighcelldensityfermentationandhighlevelexpressionofrecombinanthumanBlymphocytestimulator(E.coliDH5/pKKH-BLyS).Pilottestoftubecultureandflaskshakingcultureweredonetogetoptimizedcultureconditions,includingpHvalueforculture,inducerconcentrationofIPTG,inductiontimeandduration,rangeofdissolvedoxygenandthemanneroffeeding.Then,weperformedathree-timerepeatedfermentationundertheestablishedconditions.Thefinalcelldensitywasabout25A600andmorethan50gofwetbacteriaperlitercouldbeobtained.Theaverageexpressionlevelofrecombinantproteinwasabout40%oftotalbacterialproteins.Theresultsshowthattheestablishedfermentationprocedureisstable,ofshortcycleandwithhighexpression,whichlaysthebasisforfurtherpurificationandlarge-scaleproductionofBLyS.KeyWords:BLymphocyteStimulator,RecombinantEscherichiacoli,Highcelldensityfermentation重组人B淋巴细胞刺激因子工程菌高密度发酵薛晓畅包春杰韩苇秦鑫张存曹筑荣李维娜赵玉红张英起(第四军医大学药学系生物技术中心,西安710032)摘要：为实现重组人B淋巴细胞刺激因子工程菌E.coliDH5/pKKH-BLyS的高密度、高表达发酵,首先进行了培养条件的摸索,确定了该工程菌的最佳培养pH值、诱导剂IPTG的浓度、诱导的最佳时间段、溶氧范围以及补料的流加方式等,根据优化条件，用5L自控发酵罐进行三批重复发酵,最终菌体密度均达到25A600以上，菌体获得量均可达湿重30g以上，目的蛋白质的表达量占菌体总蛋白的40%左右，保持并超过了该重组蛋白在试管和摇瓶中的表达量。此发酵工艺具有周期短、产量高、重复性稳定性好等特点，为下游的纯化和进一步的大规模生产奠定了基础。关键词：B淋巴细胞刺激因子;重组大肠杆菌;高密度发酵中图分类号:Q516;TQ92文献标识码:A文章编号：B淋巴细胞刺激因子（BLymphocyteStimulator,BLyS）是1999年由瑞士和美国科学家发现的肿瘤坏死因子（TumorNecrosisFactor,TNF）家族的一个新成员[1]。该分子含有285个氨基酸，属于II型跨膜蛋白。BLyS主要由T细胞和树突状细胞等髓系来源的细胞分泌。BLyS以膜结合及可溶性两种方式存在于机体中，两者均具有生物学活性。研究表明BLyS在B细胞的存活和功能调节方面发挥着重要作用，它可以延长B细胞存活时间、促进其增殖，从而导致B细胞增生和自身免疫狼疮样变化的出现。BLyS的过度表达是发生自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、多发性硬化和类风湿性关节炎等的重要因素之一[2-4]。第2页共6页第1页共6页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第2页共6页BLyS已经成为治疗自身免疫性疾病的有效靶点，我们构建了人BLyS疫苗表达重组载体，动物实验表明该重组疫苗对于多发性硬化和类风湿性关节炎动物模型均具有良好的保护作用[5]。但研究结果仅局限于实验室规模。欲真正实现其价值，必须借助于高密度发酵技术，将生产提高到工业生产的规模。本文对重组人BLyS工程菌E.coliDH5/pKKH-BLyS表达和生长的特有规律进行了初步研究，并建立了一个适用于工业化的高密度、高表达生产工艺。1材料和方法1.1材料1.1.1宿主菌和质粒宿主大肠杆菌E.coliDH5[supE44lacU169(Ф80lacZM15)hsdR17recA1endA1gyrA96thi-1△△relA1]购自Invitrogen公司；原核非融合表达载体pKKH由浙江大学王宪锋博士赠送，重组质粒pKKH-BLyS由第四军医大学生物技术中心构建，基因的表达受Trc启动子控制，IPTG能诱导目的基因的表达，氨苄青霉素抗性。1.1.2培养基LB培养基用于试管种子培养，2YT培养基用于三角摇瓶培养，半合成培养基用于5L发酵罐中分批补料培养。LB培养基中含有(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10；...