重组水蛭素的聚乙二醇修饰李雪芹，候蓓蓓，赵军，田明玉，修志龙*大连理工大学环境与生命学院大连116024摘要：目的水蛭素因血浆半衰期短而严重限制了其临床应用，聚乙二醇修饰能有效地延长其半衰期。本文通过比较不同修饰位点、修饰方法所得单修饰产物的比率、纯度及其活性保留率，从而得到修饰专一性强且活性保留率较高的修饰策略。方法采用液相和固相修饰方法,用琥珀酰亚胺活化的PEG20kDa分别在pH6.0、8.0的条件下对水蛭素的His和Lys进行定点修饰；用SDS-PAGE分析产物的修饰度，并用离子交换柱对修饰后的产物进行分离，然后用凝血酶滴定法测定水蛭素单修饰产物的体外抗凝活性。另外用分子动力学模拟方法预测了pH8.0条件下PEG修饰的位点。结果在pH6.0、8.0的条件下，水蛭素单修饰率都高达90%以上，但二者的单修饰活性保留率相差较大。在pH6.0时，液、固相单修饰活性保留率为34%、34.8%；而在pH8.0时分别为55%、96%。结论在pH8.0条件下，采用“离子交换柱辅助”固相修饰的方法对Lys进行定点修饰能得到较高产率和较高活性保留率的单修饰产物。关键词：重组水蛭素；SC-mPEG；抗凝活力；分子动力学模拟PEGylationofRecombinantHirudinLiXueqin，HouBeibei，ZhaoJun，TianMingyu，XiuZhilong*DepartmentofBioscienceandBiotechnology,SchoolofEnvironmentalandBiologicalScienceandTechnology,DalianUniversityofTechnology,Dalian116024,ChinaAbstract:OBJECTHirudinisthemostpotentinhibitorofthrombinfoundinnature.Althoughhirudinhasthestrongestanti-thrombinactivityinvivo,itsshorthalf-lifeinserumsignificantlylimitsitsclinicalanticoagulantapplication.Currently,PEGylationiscommonlyusedasaneffectivemethodtoprolongitshalf-lifeinserum.OurobjectofexperimentistochoosethebestPEGylationmethodaccordingtothemonoPEGylatedrecombinanthirudin’spurityandtheanticoagulantactivityinvitro.METHODSSolutionmethodandsolidmethodassistedby“packed-bed”andanionexchangecolumnwereusedtofavortheformationofmono-PEGylatedhirudin.ThemildacidicandmildalkalinePEGylationstrategywasusedtotargetHisresidueandLysresidueofhirudinrespectivelyusingSC-mPEG20kDa.Thepegylatedproductswereisolatedbyanionexchangechromatogram.SDS-PAGEwasusedtoanalyzethepurityofPEGylatedhirudin.ThrombinmethodwasusedtoanalyzetheanticoagulantactivityofPEGylatedhirudin.MoleculardynamicsmodelingwasusedtojudgetheprobabilityofPEGylationsite.RESULTSThemono-PEGylatedproductwithapurityofmorethan90%wasobtainedatpH6.0andpH8.0.Butalargedifferenceinanticoagulantactivityexists:theanticoagulantactivityofsolutionandsolidmethodswere34%and34.8%respectivelyatpH6.0；55%、96%atpH8.0.CONCLUSIONSolidmethodassistedbyanionexchangecolumnatpH8.0wasabetterstrategytogetmono-PEGylatedr-Hirudin.Keywords：recombinanthirudin；SC-mPEG；anticoagulantactivity；moleculardynamicsmodeling前言水蛭素是含65个氨基酸残基与3个二硫键的多肽，分子量约7000，是迄今为止发现的特异性最好的凝血酶抑制剂[1],而凝血酶诱发的血液凝固是诱导血管血栓形成的重要原因，因此水蛭素对各种血栓病均有疗效。然而水蛭素有一些显著的药用缺点，如血浆半衰期较短，一般只有60-100分钟，患者需不断注射才能维持抗凝效果，导致治疗成本较高，且重复注射也会引起一些不良反应[2-4]。上世纪70年代以来，人们发现一些蛋白经过PEG修饰后，很多方面的药用特性大大改善。之后，人们开展了对于水蛭素的PEG修饰研究。GeorgeC.Avgerinos[5]等人采用基因工程方法对水蛭素氨基酸进行改造，用甲基营养酵母Hansenylapolymorpha特异性表达了只含两个Lys的水蛭素，采用对硝基碳酸酯活化的PEG5kDa进行修饰，并设计了工业等级纯化步骤。这种对水蛭素修改的方式可以大大提高修饰产物的专一性，但是研究周期性较长且须具备一定的科研条件。国内也有关于水蛭素PEG修饰的研究。于爱平[6]等人采用SPA-PEG5kD...
