2010届第二学期高三生物一轮复习教学案017选修一多聚酶链式反应扩增DNA片段【学习目标】1、了解PCR技术的基本操作2、理解PCR的原理3、讨论PCR的应用【知识梳理】一、PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：1．1细胞内DNA复制条件分析：条件组分作用模板DNA的两条单链提供复制的模板原料四种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料酶解旋酶DNA聚合酶打开DNA双螺旋催化合成DNA子链能量ATP为解螺旋和合成子链供能引物RNA为DNA聚合酶提供合成的3’端起点1．2细胞内DNA复制过程（1）DNA的反向平行结构：由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链，DNA双螺旋结构的反向平行结构：（2）DNA的复制过程:解旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，，形成两条DNA单链。引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。DNA聚合酶结合：子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来。子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此RNA的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？RNA合成、蛋白质合成。1．3DNA分子复制的人工控制解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。反应场所：PCR仪（自动温度周期性调节）。［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）4．PCR的反应过程变性：在95℃时DNA解旋复性：在50℃时引物与DNA单链结合延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）2．实验操作2．1PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水2．2实验操作步骤2．3按照PCR反应体系配方配制反应液；（2）将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；（3）将微量离心管放到PCR仪中；（4）设置PCR仪的工作参数。（5）DNA在PCR仪中大量扩增。2．4水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。3．实验注意事项3．1避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。3．2缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。变性复性延伸3．3每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。3．4混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。4．结果分析与评价4．1反应液稀释：取2µLPCR反应液，添加98µL蒸馏水；2．分光光度计调零：将100µL蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。4．2将100µL反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。4．3计算：DNA含量＝50×光吸收值×稀释倍数（三）课堂总结、点评【例题分析】【例1】在（）的温度范围内，DNA的双螺旋结构解开A.10－20℃B.80－100℃C.20－30℃D.40－60℃【例2】关于DNA的复制，下列叙述正确的是（）A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3’端延伸DNA链B.DNA复制不需要引物C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合D.DNA的合成方向总是从子链的3’端向5’端延伸【例3】下列有关PCR描述，不正确的是（）A.是一种酶促反应B.引物决定了扩增的特异性C.扩增产量按y＝（1＋X）nD.扩增对象是氨基酸序列E.扩增对象是DNA序列【基础检测】1．DNA分子复制时，解旋的两条链中（）多聚酶链式反应扩增DNA片段PCR原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响PCR过程变性复性延伸操作步骤配制PCR反应体系移入离心管放入PCR设置工作参数DNA扩增测定含量稀释调...
