代谢型谷氨酸受体4亚型(mGluR4)高通量药物筛选模型的建VIP免费

生物技术与方法生物工程学报ChinJBiotech2009,March25;25(3):457-463journals.im.ac.cnChineseJournalofBiotechnologyISSN1000-3061cjb@im.ac.cn©2009InstituteofMicrobiology,CAS&CSM,Allrightsreserved代谢型谷氨酸受体4亚型(mGluR4)高通量药物筛选模型的建立张娅玲1,2,白艳秋1,21中国科学院北京基因组研究所,北京1013002中国科学院研究生院,北京100039摘要:为发现代谢型谷氨酸受体4亚型(mGluR4)的调节剂,通过荧光检测胞内钙浓度的方法,建立一个基于细胞功能性检测的高通量筛选(HTS)系统。将人mGluR4基因转染稳定表达G15蛋白的人胚肾细胞(HEK-293),用Zeocin筛选获得稳定表达mGluR4的细胞株,并通过钙流检测试验证实该细胞系的生物学功能。优化了实验系统中荧光染料的孵育时间,溶剂二甲基亚砜(DMSO)耐受性,以及溶剂氢氧化钠(NaOH)耐受性,建立了可靠稳定的筛选系统。钙流检测试验数据表明,mGluR4细胞系对其激动剂的活性程度排序是:L-(+)-2-Amino-4-phosphonobutyricacid(L-AP4)>L-Serine-O-phosphate(L-SOP)>L-Glutamicacid(L-Glu);拮抗剂是:(RS)--Methylserine-O-phosphate(MSOP)>(RS)--Methyl-4-phosphonophenylglycine(MPPG)。在96和384细胞微孔培养板中,得到该筛选系统Z’因子分别是0.80和0.65。结果表明,该稳定细胞系拥有一个稳定的检测系统,适合于mGluR4激动剂/拮抗剂的筛选。关键词:代谢型谷氨酸受体4亚型(mGluR4),高通量筛选(HTS),G15,激动剂/拮抗剂Developmentofafunctionalcell-basedHTSassayfortheidentificationmGluR4modulatorsYalingZhang1,2,andYanqiuBai1,21BeijingInstituteofGenomics,ChineseAcademyofSciences,Beijing101300,China2GraduateUniversityoftheChineseAcademyofSciences,Beijing100039,ChinaAbstract:Toidentifymetabotropicglutamatereceptor4(mGluR4)modulatorsbyCa2+influxassay,wedevelopedthefunctionalcell-basedhighthroughput-screening(HTS)assay.ThehumanmGluR4cDNAwastransfectedintoHEK-293stablyexpressingpromiscuousG-protein(G15)cells.RecombinantstablemGluR4celllinewasselectedunderZeocinandvalidatedbyCa2+influxassay.TheassaywasoptimizedonloadingtimeofFluoCalciumIndicator,Dimethylsulfoxide(DMSO)toleranceandsodiumhydroxide(NaOH)toleranceusingagonist(L-Glutamicacid(L-Glu))ofmGluR4.TherankorderoftheagonistpotencyforthestablehumanmGluR4celllinewasL-(+)-2-Amino-4-phosphonobutyricacid(L-AP4)>L-Serine-O-phosphate(L-SOP)>L-Glu,andoftheantagonistpotencywas(RS)--Methylserine-O-phosphate(MSOP)>(RS)--Methyl-4-phosphonophenylglycine(MPPG).Z’factorvalueofthecelllinein96-and384-wellplateformatwas0.80and0.65.OurdataindicateasuccessfuldevelopmentoffunctionalhumanmGluR4recombinantstablecelllinethatwassuitableforhighthroughputscreeningtoidentifymGluR4agonist/antagonist.Keywords:metabotropicglutamatereceptor4(mGluR4),highthroughputscreening(HTS),G15,agonist/antagonistReceived:October24,2008;Accepted:December30,2008Correspondingauthor:YalingZhang.Tel:+86-10-80481755;E-mail:zhangyl@big.ac.cn眉题2谷氨酸是公认的最重要的兴奋性神经递质之一,其在众多的中枢神经功能方面发挥着重要的作用,例如:记忆的获取与学习,癫痫、中风等功能紊乱,神经退行性疾病等[1]。L-谷氨酸通过与谷氨酸受体相结合发挥其生理作用[2,3]。谷氨酸受体分为2类:离子型谷氨酸受体(Ionotropicreceptors)和代谢型谷氨酸受体(Metabotropicreceptors)。离子型谷氨酸受体(iGluRs)包括3个亚型:IV_甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)、红藻氨酸(Kainicacid)和使君子氨酸受体(-amino-3-hydroxy-5·methyl-4.isoxazolepropionate,AMPA),该类受体被激活后能促使离子通道开放,从而阳离子如Na+、Ca2+等进入细胞内;代谢型谷氨酸受体(mGluRs)包括mGluR1-8共8个受体亚型,为G蛋白偶联受体家族成员[4],有7个跨膜结构,通过介导第二信使来调节受体生理功能[5]。根据代谢型谷氨酸受体氨基...