第1页共49页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第1页共49页1.HPLC法测定大鼠血浆中的山奈酚1.1目的要求1.掌握血浆样品的前处理方法。2.熟悉方法回收率和萃取回收率实验操作和评价。3.熟悉大鼠眼眶采血技术；熟悉方法学研究中其他评价内容。1.2主要实验材料与仪器山奈酚（Kaempferol）及其对照品，黄芩素（baicalein），抗坏血酸，肝素，β-葡萄糖醛酸苷酶（β-glucuronidase）和硫酸酯酶（sulfatase），分析纯甲醇，冰醋酸、无水乙醚，色谱纯乙腈；高效液相色谱仪，氮吹装置，恒温水浴，漩涡混合器，13000r/min台式离心机，不同规格移液枪（5,20,50,100,200,1000μL）和容量瓶（10，25mL），5~10mL具塞离心管若干；雄性SD大鼠（180~220g）。第2页共49页第1页共49页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第2页共49页1.3实验原理山奈酚吸收进入体内后，多以二相代谢物葡萄糖醛酸苷和硫酸酯的形式存在。由于山奈酚葡萄糖醛酸苷和硫酸酯的对照品难以获得，故采用加入硫酸酯和葡醛酸苷水解酶处理样品，使代谢物水解后测定苷元山奈酚的浓度。实验以黄芩素为内标，HPLC法测定血浆中山奈酚浓度，对建立的方法进行方法学评价。1.4实验方法1.色谱条件：C18柱（250mm×4.6mm，5μm），配保护柱，柱温40℃；乙腈-0.5%冰醋酸（35:65）为流动相，流速1mL/min；检测波长370nm；进样量20μL。2.溶液配制：取山奈酚对照品约2.5mg，精密称定，置25mL量瓶中，用甲醇溶解并定容。精密吸取适量，分别用甲醇稀释成0.3、0.6、3、6、9、20和30μg/mL的标准系列溶液，置4℃冰箱保存。另取黄芩素适量，精密称定，用甲醇溶解并定量稀释至0.1mg/mL的溶液，精密吸取1.5mL置10mL量瓶中，用甲醇定容，第3页共49页第2页共49页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第3页共49页得内标溶液，置4℃冰箱保存。3.血浆样品处理：取大鼠血浆样品120μL，加入甲醇20μL、1%冰醋酸（含2mg/mL抗坏血酸）32μL、β-葡萄糖醛酸苷酶（20U/mL）和硫酸酯酶（6U/mL）的混合水溶液50μL，37℃水浴温育30min后，加入内标溶液50μL，然后加无水乙醚2mL，漩涡混合5min，于12000r/min离心5min；取上清液在氮气流下挥干，残留物用100μL甲醇复溶，12000r/min离心5min，取上清液进样分析。4.专属性考察：取空白血浆、添加山奈酚与内标的空白血浆、血浆样品，按“血浆样处理”项下方法处理，照“色谱条件”项下方法进样测定。比较所得色谱图，考察血浆内源性物质是否干扰测定，药物及内标是否达到基线分离。若有必要，适当调整色谱条件，已达到专属性要求。5.标准曲线制备：精密吸取120μL大鼠空白血浆9份，分别加入20μL不同浓度的标准系列溶液，制得0.0（空白）、0.0（空白+内标）、0.05、0.1、0.5、1.5、3和5μg/mL的山奈酚血浆标准溶液第4页共49页第3页共49页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第4页共49页（每个浓度点平行3~5份）。按“血浆样品处理”项下自“加1%冰醋酸32μL”起，同法处理后进样分析，记录峰面积。以山奈酚与内标峰面积的比值（R）对山奈酚血浆浓度（C）进行线性回归（两个空白不计入回归曲线，仅作为对干扰的考察），求得回归方程（R=bC+a）和相关系数（r）。并取各浓度点实测值代入回归方程得回归值（C′）,与标示值（C）比较，计算偏差（偏差%=C'−CC×100%）和准确度（准确度=C′/C×100%）。根据上述结果确定线性范围与定量下限（LLOQ）。6.回收率和精密度试验：精密吸取120μL大鼠空白血浆，分别加入不同浓度的山奈酚标准溶液，配制低、中、高（0.1、1、4μg/mL）三种浓度的山奈酚血浆样品，每浓度点平行5份，按“标准曲线制备”项下方法进行处理、测定。将山奈酚与内标峰面积比值代入标准曲线，求出测得浓度。计算测得浓度与加入浓度的比值，得方法回收率，并计算各浓度点的相对标准差（RSD），作为日间精第5页共49页第4页共49页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第5页共49页密度；于不同日（至少3d）重复上述测定，计算日间精密度。7.萃取回收率试验：精密吸取120μL大...
