植物生物技术考试题四,脓杆菌介导转基因的程序,并说明影响转化效率的因素举例说明原理：农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞)，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减速分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应，主要包括：①受伤的植物细胞为修复创伤部位，释放一些糖类、酚类等信号分子。②在信号分子的诱导下，农杆菌向受伤组织集中，并吸附在细胞表面。③转移DNA上的毒粒基因被激活并表达，同时形成转移DNA的中间体。④转移DNA进入植物细胞，并整合到植物细胞基因组中。方法：（根据不同受体环境基因要求而不同）1．农杆菌准备2．外植体的准备（愈伤组织、悬浮细胞系、幼嫩茎段或叶片）;3．用MS-AS液体培养基稀释原菌液15倍（1.5ml/20ml）或离心后稀释3倍;4．外植体与菌液共培养20分钟;5．放置在带滤纸的培养皿上（注意充分吸干多余的菌液）;6．将外植体接种到MS-AS固体诱导培养基，培养2－3天;7．移至含卡那霉素（Kan）300mg/L和羧苄青霉素（Cb300mg/L）的固体筛选培养基上进行Kan抗性愈伤组织的筛选;8．隔20天，进行第二次筛选；9．抗性愈伤组织在固体筛选培养基上分化成苗；10在生根培养基上生根，获得完整的再分化植株。五,DNA分子标记的种类及优缺点RFLP、VNTR、RAPD、DAF、AP-PCR、ISSR、SSR、SCAR、STS、AFLP、SNP、InDel、CAPS、dCAPS、SRAP、EST1RFLP该技术由Grodzicker等于1974年创立特定生物类型的基因组DNA经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片段，或称限制性等位片段RFLP标记技术的基本原理就是通过电泳的方法分离和检测这些片段凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP该技术包括以下基本步骤：DNA提取；用DNA限制性内切酶消化；凝胶电泳分离限制性片段；将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作的滤膜上；用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作探针与膜上的DNA杂交（称Southern杂交）；放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性RFLP标记的主要特点有：（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（2）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果稳定可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中2RAPD由William等于1990年创立其基本原理与PCR技术一致PCR技术是一种体外快速扩增特异基因或DNA序列的方法，由Mulli等于1985年首创该技术在试管中建立反应体系，经数小时后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数百万倍其原理与细胞内发生的DNA复制过程相类似，首先是双链DNA分子在邻近沸点的温度下加热时便分离成两条单链DNA分子，然后DNA聚合酶以单链DNA为模板，并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）合成新生的DNA互补链，以上过程为一个循环，每一个循环的产物可以作为下一个循环的模板，经过20-30个循环后，介于两个引物间的特异DNA片段以几何数得以大量复制RAPD标记技术就是用一个（有时用两个）随机引物（一般8-10个碱基）非定点地扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段遗传材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发生DNA片段插入缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致PCR产物增加缺少或发生分子量变化...
