试验六酵母蔗糖酶的提取及纯化VIP专享VIP免费

实验六酵母蔗糖酶的提取及纯化原理蔗糖酶（invertase）（—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranosidefructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解1mol蔗糖，就生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。＋H2O在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。蔗糖酶OHHO一、蔗糖酶的提取与部分纯化（一）实验目的学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。（二）实验原理（略）（三）实验仪器、材料及试剂仪器1.高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱2.电子天平、研钵（＞200ml）、制冰机、50ml烧杯3.离心管（2ml，10ml，30ml或50ml）、移液器（1000ul）或滴管、量筒材料及试剂1.市售鲜啤酒酵母（低温保存）2.石英砂（海沙）、甲苯（使用前预冷到0℃以下）3.95%乙醇（预冷－20℃）、去离子水（使用前冷至4℃左右）4.Tris-HCl（pH7.3）缓冲液（四）操作步骤1.提取（1）将市售鲜啤酒酵母2000rpm，离心10min，除去大量水分。（2）将研钵稳妥放入冰浴中。（3）称取50g鲜啤酒酵母，加30g石英砂放入研钵中，加50ml预冷的甲苯（边研边加）或预冷的去离子水，在研钵内研磨成糊状，然后每次缓慢加入预冷的10ml去离子水，边加边研磨以便将蔗糖酶充分转入水相。共加75ml去离子水，研磨约40~60分钟，使其成糊状液体。（注：研磨时可用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎）。（4）将混合物转入50ml（或分装入2个30ml）离心管中，平衡后，用高速冷冻离心机离心，4℃，15000rpm，15min。观察结果：如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。（4）用移液器（或滴管）吸出上层有机相（弃掉）。（5）用移液器小心地取出脂肪层下面的水相液转入量筒，量出体积，并记录。（6）取出2ml放入2ml离心管中（标记为粗级分I，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中。2.热处理（1）将盛有粗级分I的小烧杯迅速地放入50℃恒温水浴中，保持30分钟，并用玻璃棒温和搅动。（2）取出小烧杯，迅速用冰浴冷却，转入清洁的离心管中（根据量大小选择离心管），4℃，15000rpm，离心15min。（3）将上清液转入量筒，量出体积，并记录。（4）取出2ml放入2ml离心管中（标记为热级分II，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中。3.乙醇沉淀（1）将盛有热处理后的上清液放入小烧杯，在冰浴下逐滴加入预冷的等体积（逐滴加入）95%乙醇，温和搅拌、放置，需1小时。（2）转入清洁的离心管中，用4℃，15000rpm，离心15min，倾去上清，并滴干。（3）离心管中沉淀用5~8mlTris-HCl（pH7.3）缓冲液充分溶解（若溶液混浊，则用离心管，4000rpm离心除去不溶物），转入量筒，量出体积，并记录。（4）取出2ml放入2ml离心管中（标记为醇级分Ⅲ，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中，用于下一步实验。（注：离心管中沉淀也可盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱中冷冻保存，用时再处理）（五）实验结果与分析记录实验结果，并加以解释，若有异常现象出现，可进行分析讨论。（六）注意事项二、蔗糖酶活性及蛋白质浓度的测定（一）实验目的学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度，用Nelson方法测定酶活力。掌握各步骤的实验原理和方法。（二）实验原理本实验以Nelson方法测定酶活...