实验一质粒DNA的提取纯化和检测一、实验目的1.掌握碱裂解法提取质粒。2.学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法。二、实验原理质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。质粒DNA的提取纯化从宿主细胞中提取质粒DNA主要有三个步骤：1、培养细菌使质粒扩增。2、收集和裂解细菌。3、分离和纯化质粒DNA。在不同pH值溶液中，质粒DNA与染色体DNA变性与复性的性质不同。在pH值高达12.6的碱性溶液中，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.6的醋酸钠高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。溶于上清液中的质粒DNA，利用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase酶降解。添加到DNA溶液中的RNase酶以及一些可溶性蛋白，通过苯酚氯仿抽抽提而除去，最会获得纯度较高的质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子的高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，本次实验所用的pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA；开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂；线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。借助溴化乙锭(EB)能与双链DNA结合的作用，利用EB染色，并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。三、实验材料、试剂及仪器1.E.coliDH5α（pUC19）2.LB培养基3.TE缓冲液4.溶液Ⅰ:50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)，10mmol/LEDTA。溶液Ⅱ:0.2MNaOH，1%SDS(临用前用10mol/LNaOH和10%SDS母液稀释)溶液Ⅲ5.RNase6.酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)7.无水乙醇和70%乙醇8.氨苄青霉素50mg/mL9.离心机、离心管、微量移液器等。四、操作步骤1.细菌的培养(扩增质粒)在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上挑取带有质粒pUC19的大肠杆菌单菌落，接种于20mlLB(含80μg/ml氨苄青霉素)液体培养基中，37℃振荡过夜培养。取5ml接种于50mlLB(含氨苄青霉素)培养基中，37℃震荡培养6h左右。2.质粒DNA提取(1)称量离心管重量，倒菌液至管口1.5cm左右处。6000rpm离心5min，弃去培养液，用枪尖吸尽可能吸干培养液。(2)加入溶液Ⅰ5ml，混匀，6000rpm离心5min，弃去上清液，称量重量，计算出菌重(135mg)，按照每100mg菌加溶液Ⅰ1ml加溶液1ml，剧烈振荡，使细菌完全分散，将离心管置于冰上5min左右。(3)以2倍溶液Ⅰ体积的量加入新配制的溶液Ⅱ(2ml)慢慢颠倒混匀，(切勿剧烈震荡！)将离心管置于冰上5min，此时溶液变粘稠如蛋清状。(4)以1.5倍体积溶液Ⅰ体积的量加入用冰预冷的溶液Ⅲ(1.5ml)，慢慢颠倒数次，使之在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，然后将离心管置于冰上5-10min，此时有白色絮状物沉淀。(5)12000rpm离心15min，将上清液转移到另一洁净离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇和1/10体积NaAc，混匀，-20...
