木薯MeSWEET10a基因启动子EBE区编辑载体的构建及验证VIP免费

木薯MeSWEET10a基因启动子EBE区编辑载体的构建及验证作者：张彤王亚杰郭文雅李瑞梅刘姣郭建春胡新文姚远耿梦婷来源：《热带作物学报》2021年第11期摘要：木薯细菌性枯萎病（cassavabacterialblight，CBB）是由地毯草黄单胞木薯萎蔫致病变种（Xanthomonasaxonopodispv.Manihotis，Xam）引起的木薯重要病害，影响木薯产量，我国主栽的木薯品种均不抗Xam。Xam分泌的TAL20效应蛋白可结合木薯MeSWEET10a基因启动子的EBE区，激活该基因表达，促进糖类运输至Xam侵染的部位，为病菌的繁殖提供碳水化合物。本研究利用在线软件CRISPR-Pv2.0设计EBE区的基因编辑靶点，构建CRISPR/Cas9基因编辑质粒pCAMBIA1301-Cas9-EBE-sgRNA。将重组质粒转化LBA4404根癌农杆菌，利用农杆菌介导法侵染木薯脆性胚性愈伤组织。提取侵染和未侵染的木薯脆性胚性愈伤组织DNA，PCR扩增靶点EBE区及潜在的脱靶位点，并进行Sanger测序分析编辑效果。结果发现EBE区被成功编辑，且没有脱靶现象。本研究有助于进一步获得MeSWEET10a基因启动子EBE区域的木薯突变体，以增强木薯抗细菌性枯萎病的能力。关键词：木薯;细菌性枯萎病;MeSWEET10a;CRISPR/Cas9中图分类号：S533文献标识码：AAbstract：Cassavabacterialblight（CBB）isanimportantcassavadiseasecausedbyXanthomonasaxonopodispv.manihotis（Xam），whichaffectstheyieldofcassava.ThemaincassavavarietiesinChinaarenotresistanttoXam.TheTAL20effectorproteinsecretedbyXam，couldbindtotheEBEregionofthecassavaMeSWEET10apromoter，activatethegeneexpression，promotethetransportofsugarstothesiteofXaminfection，andprovidecarbohydratesforthereproductionofthepathogen.Inthisstudy，thegeneeditingtargetofEBEregionwasdesignedbyusingonlinesoftwareCRISPR-Pv2.0，andtheCRISPR/Cas9geneeditingplasmidpCAMBIA1301-Cas9-EBE-sgRNAwasconstructed.TherecombinantplasmidwastransformedintoAgrobacteriumtumefaciensLBA4404，andthefragileembryogeniccalliofcassavawasinfectedbytheA.tumefaciens-mediatedmethod.DNAwasextractedfromthefragileembryogeniccalliofinfectedanduninfectedcassava.ThetargetEBEregionandpotentialmisssiteswereamplifiedbyPCR，andtheeditingeffectwasanalyzedbySangersequencing.ItwasfoundthattheEBEregionwaseditedsuccessfullywithoutoff-targetphenomenon.ThisstudyishelpfultofurtherobtaincassavamutantsintheEBEregionofMeSWEET10apromoterandenhancetheresistanceofcassavatobacterialblight.Keywords：cassava;bacterialblight;MeSWEET10a;CRISPR/Cas9DOI：10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.010木薯是热带地区重要的粮食作物，而病害是木薯产量提高的重要制约因素之一[1-2]。木薯细菌性枯萎病（cassavabacterialblight，CBB）是我国木薯面临的主要病害，该病是由地毯草黄单胞菌木薯萎蔫致病变种（Xanthomonasaxonopodispv.Manihotis，Xam）引起的细菌性病害[3]。我国木薯主栽品种均不抗Xam病原菌的侵染，CBB曾导致我国木薯大面积减产。因此，培育抗CBB木薯新品种有益于我国木薯产业持续健康发展。Xam病原菌侵染木薯时，可通过Ⅲ型分泌系统将转录激活因子样效应物蛋白（transcriptionactivator-likeeffectors，TAL）分泌到宿主细胞中[4]，TAL效应蛋白的可变重复区（repeatvariablediresidues，RVD）识别宿主感病相关基因启动子上的效应蛋白结合元件（effector-bindingelement，EBE），并激活下游感病基因表达，以促进Xam病原菌的侵染[5]。不同的Xam病原菌菌株包含的TAL效应蛋白数目存在差异，一般为1～5个。其中TAL20的RVD区可识别木薯糖转运蛋白编码基因MeSWEET10a启动子的EBE区，激活MeSWEET10a基因的表达，以利于糖类物质转运至Xam病原菌侵染部位，以促进病原菌的繁殖[6]。因此，MeSWEET10a基因启动子的EBE区是利用基因编辑技术创制抗CBB木薯种质的重要靶标。类似的抗病育种策略已应用水稻抗白叶枯病育种。利用基因编辑技术，编辑水稻SWEET基因启动子EBE区，阻止水稻白叶枯病病原菌水稻黄单胞菌水稻致病变种（...