蛋白质组学及其主要技术VIP免费

蛋白质组学及其主要技术朱红1周海涛2(综述)何春涤1,(审校)(1.中国医科大学附属第一医院皮肤科,辽宁沈阳110001；2.北京大学深圳医院核医学科，广东深圳518036)【摘要】蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象的新兴学科，近年来发展迅速，已成为后基因组时代的研究热点。目前，蛋白质组学研究技术主要包括：样品的制备和蛋白质的分离、蛋白质检测与图像分析、蛋白质鉴定及信息查询。本文就蛋白质组学概念及主要技术进行综述。【关键词】蛋白质组，蛋白质组学1蛋白质组学的概念随着人类基因组测序计划的完成，人们对生命科学的研究重点由结构基因组转向功能基因组，1994年Wilkins和Williams首先提出蛋白质组一词[1]，蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。从基因到蛋白质存在转录水平、翻译水平及翻译后水平的调控，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度不完全符合[2]。蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质-蛋白质相互作用等也无法从DNA／mRNA水平来判断。因此，只有将功能基因组学与蛋白质组学相结合，才能精确阐明生命的生理及病理机制。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，对组织、细胞的整体蛋白进行检测，包括蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和蛋白质的相互作用,在蛋白质水平上了解细胞各项功能、各种生理、生化过程及疾病的病理过程等[3,4]。蛋白质组学有两种研究策略。一种是高通量研究技术，把生物体内所有的蛋白质作为对象进行研究，并建立蛋白质数据库，从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，更符合蛋白质组学的本质。但是，由于剪切变异和翻译后修饰，蛋白质数量极其庞大，且表达随空间和时间不断变化，所以分析生物体内所有的蛋白质是一个耗时费力，难以实现的理想目标。另一种策略是研究不同状态或不同时期细胞或组织蛋白质组成的变化，主要目标是研究有差异蛋白质及其功能，如正常组织与肿瘤组织间的差异蛋白质，寻找肿瘤等疾病标记物并为其诊断治疗提供依据。2蛋白质组学的常用技术2.1样品的制备和蛋白质的分离技术2.1.1样品的制备样品制备包括细胞裂解与蛋白质溶解，以及去除核酸等非蛋白质成分。激光捕获显微切割(Laser-capturedmicrodissection,LCM)[5]技术可大量获得足够用于蛋白质组学研究的单一细胞成分，避免其他蛋白成分对电泳结果的干扰。尤其是肿瘤的蛋白质组学研究常用LCM技术来获取单一的肿瘤细胞。2.1.2蛋白质的分离技术①双向凝胶电泳(Two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)：双向电泳方法于l975年由O'Farrell[6]首先提出，根据蛋白质等电点和分子量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳将其分离。第一向为等电聚焦(Isoelectricfocusing,IEF)电泳，其基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行蛋白质的分离。较早出现的IEF是载体两性电解质pH梯度，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度；20世纪80年代初建立起来的固相pH梯度(ImmobilizedpHgradients，IPG)IEF，是利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度。IPG胶实验的重复性好。第二向为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE)，它是按蛋白质分子量的大小进行分离，双向电泳的最新进展是用IPG干胶条代替两性电解质加上与干胶条相配套的电泳仪如PROTEANIEFCell、IPG-phort等进行第一向等电聚焦[7,8]，不仅极大地提高了电泳的分辨率，也提高了结果的重复性，尤其是不同实验室之间结果的可比性。2-DE最大的应用是能分离相同分子量的同分异构体以及经过翻译后修饰的蛋白质，蛋白质经过诸如磷酸化后，其电荷数量发生改变。通常蛋白质的磷酸化形式可以与未磷酸化的对应物分离开，在双向电泳胶上出现一串水平斑点。虽然该技术不断的发展,依然存在一些不足:疏水性强及强酸强碱性蛋白质无法用2-DE进行检测、低拷贝的蛋白质很难被检测到、检测分子量有一定范围、样品上样量相对少使得检测的灵敏度受到限制。而且电泳结果需染色处理，而不同蛋白质与染料的结合差异较大。另外该...