分子生物学基本技术VIP免费

分子生物学基本技术包括核酸的纯化，体外合成、分子杂交、基因克隆、基因表达研究技术等第一节DNA的体外合成一、DNA的化学合成（无要求）一亚磷酸三酯法DNA的化学合成广泛用于合成寡核苷酸探针和引物，有时也用于人工合成基因和反义寡核苷酸。目前寡核苷酸均是用DNA合成仪合成的，大多数DNA合成仪是以固相亚磷酸三酯法为基础设计制造的合成的原理：核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载体上，然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接长。每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作，由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上，所以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方法除去。合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割下来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终产物。（末端核苷酸的3’-OH与固相载体成共价键，5’-OH被二甲氧基三苯甲基（DMT）保护，下一个核苷酸的5’-OH亦被DMT保护3’-OH上的磷酸基上氨基亚磷酸化合物活化碱基上的氨基用苯甲酸保护。每延伸一个核苷酸需四步化学反应（1）脱DMT游离出5’-OH。⑵缩合（偶联反应）：新生成的5’-OH与下一个核苷活化的3’单体缩合成亚磷酸三酯使链增长（3）盖帽（封端反应）：有少量（小于0.5%）未缩合的5’-OH要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。（4）氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷（磷酸三酯）。上述步骤循环一次，核苷酸链向5’方向延伸一个核苷酸二、聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）是一种体外特定核酸序列扩增技术。一）PCR的基本原理双链DNA热变性成两条单链，降温使反应体系中的两个引物分别与两条DNA单链两侧的序列特异性复性，在合适的条件下，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，利用反应体系中的4种dNTP合成其互补链（延伸），在适宜的条件下,这种变性一复性一延伸的循环重复1次DNA的量可以增加1倍，30次循环后，DNA的量增加230倍。（二）典型PCR的反应体系1.耐热DNA聚合酶：耐热DNA聚合酶包括TaqDNA聚合酶，TthDNA聚合酶，VENTDNA聚合酶，SacDNA聚合酶。其中Taq聚合酶应用最广泛。Taq酶在92.5°C、95°C和97.5C时半衰期分别为40min、30min和5-6min，故PCR中变性温度不宜高于95CoTaq酶的最适温度是72C，较高温度下的DNA合成错误率较低。因此一次加酶可满足PCR反应全过程的需要，使PCR走向自动化。纯化的TaqDNA聚合酶有5,-3,外切酶活性，而无3，-5/外切酶活性，无校对活性。因此在PCR中每2X104个核苷酸中有可能掺入1个错误核苷酸，这对一般的PCR产物分析不会有多少影响，但将PCR扩增产物用于分子克隆时，需使用更准确的DNA聚合酶。在100ML反应体系中，一般需TaqDNA聚合酶0.5-5单位，酶浓度过高，可引起非特异产物的扩增，浓度过低则扩增产物量减少。TaqDNA酶可在-20°C贮存至少6个月2.PCR反应的缓冲液：PCR的缓冲液一般制成10X，含有：500mmol/LKCl;100mmol/LTris-HCl(pH8.3)；15mmol/LMgCl2;0.1%明胶。使用时要稀释10倍。其中Tris-HCl可维持反应体系的pH,KCl有利于引物的退火，但浓度过高会抑制TaqDNA聚合酶的活性，明胶可保护酶不变性失活，Mg2+能影响Taq酶的活性，影响反应的特异性和扩增DNA的产率，因此要将Mg2+浓度调至最佳。3•引物：PCR反应成功扩增的一个关键条件在于寡核苷酸引物的正确设计。引物设计一般遵循以下原则：(1)引物长度一般为15-30b，引物太短，就可能同非靶序列杂交得到不需要的扩增产物。(2)G+C含量G+C含量一般为40%-60%。引物的G+C含量和引物Tm值应该协调，按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值。(3)碱基的随机分布引物中4种碱基应随机分布，不要多个嘌呤或多个嘧啶连续出现。引物自身不应存在互补序列，以免自身折叠成发夹结构影响与模板的退火结合。两引物之间也不应有互补性，尤其是避免3，端的互补而形成引物二聚体，使靶序列的扩增量下降。(4)引物浓度引物的浓度一般为0.1-0.5pmol/L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增。4.dNTP：dNTP常用的浓度为20-200pmol/L，而且4种dNTP的终浓度相等。dNTP浓度...