题目：碱性磷酸酶动力学参数的测定（创新实践活动论文）2015年4月24日·北京1不同缓冲液对碱性磷酸酶动力学参数的影响摘要酶促反应动力学主要研究酶催化的反应速率以及影响反应速率的各种因素，为了更好的发挥酶的高效性，就必须准确把握酶促反应的条件。本文重点研究不同缓冲液所配制的酶液对酶促反应的影响。实验利用碱性磷酸酶溶解在TRIS，碳酸钠，去离子水等缓冲液中为酶液，磷酸苯二钠为基质，进行实验，得到去离子水为最适缓冲液的结果，表明以去离子水为缓冲液所配制的酶液能使酶发挥最好的效果，具有研究意义。关键词：碱性磷酸酶；缓冲液；动力学参数；本试验以碱性磷酸酶为催化剂，磷酸苯二钠为底物，在一定温度、pH及酶量的条件下，碱性磷酸酶催化磷酸苯二钠转化为苯酚；利用分光光度计测定在不同底物浓度下苯酚的生成量。通过实验可以加深对有关酶促反应动力学基本知识的理解和记忆；并熟记利用双倒数法测定酶Km值的原理，熟悉试验方法。1实验材料、试剂与仪器1.1材料与试剂实验中使用的主要试剂有磷酸苯二钠:国药集团化学试剂有限公司分析纯醋酸镁：天津市永大化学试剂开发中心分析纯醋酸：北京化工厂分析纯碱性磷酸酶：北京化工厂分析纯4-氨基安替比林：天津市永大化学试剂有限公司分析纯铁氰化钾：北京化工厂分析纯硼酸：北京化工厂分析纯苯酚：天津市福晨化学试剂厂分析纯三羟甲基氨基甲烷（Tris）：北京化学试剂公司分析纯NaOH：北京化工厂分析纯碳酸钠：天津光复科技发展有限公司分析纯碳酸氢钠：天津市福晨化学试剂厂分析纯实验中使用的主要溶液有（1）0.1mol/L碳酸盐缓冲溶液（pH=10）：碳酸钠1.5875g，碳酸氢钠0.84g，蒸馏2水溶解至250mL。（2）0.04mol/L基质溶液：磷酸苯二钠0.436g（无结晶水），用煮沸冷却的蒸馏水溶解至50mL，盛于棕色瓶，冰箱内保存。（3）0.1mol/L醋酸镁溶液:醋酸镁1.0725g，蒸馏水溶解至50mL。（4）pH8.8Tris缓冲溶液：Tris1.21g，蒸馏水溶解至100mL，取此溶液10mL，加蒸馏水80mL，再加0.1mol/L醋酸镁10mL，混匀后用1%的醋酸调节pH值至8.8，用蒸馏水稀释至100mL即可。（5）0.5mol/LNaOH溶液：NaOH5g，蒸馏水溶解至250mL。（6）酶液：碱性磷酸酶1.25mg，用pH8.8的Tris缓冲溶液配制50mL，冰箱内保存。碱性磷酸酶1.25mg，用pH=10的碳酸钠缓冲溶液配制50mL，冰箱内保存。碱性磷酸酶1.25mg，用去离子水为缓冲溶液配制50mL，冰箱内保存。（7）0.3%4-氨基安替比林液：4-氨基安替比林液0.3g，碳酸氢钠4.2g，蒸馏水溶解至100mL。（8）0.3%铁氰化钾溶液：铁氰化钾1.25g，硼酸3.75g，，各溶于100mL蒸馏水中，溶解后混合至250mL，盛于棕色瓶，冰箱内保存。（9）酚标准溶液：苯酚1.5g，溶于0.1mol/L盐酸至1000mL，为储备液。取此储备液25mL，标定后用蒸馏水稀释至0.1mg/mL作为标准溶液。1.2仪器烧杯（100mL）6量筒，移液管，试管，试管架分光光度计型号UV2300上海天美科学仪器有限公司电子天平型号AL204-IC梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司恒温水浴等型号DF-101S金坛市晶玻实验仪器厂2试验方法与步骤2.1标准曲线的制备取酚标准液0.00、0.05、0,10、0.20、0.30、0.40mL于6支试管中，分别加蒸馏水至2.00mL后，37℃水浴中保温5min，然后各加入0.5mol/LNaOH溶液1.00mL、0.3%4-氨基安替比林液1.00mL、0.3%铁氰化钾溶液2.00mL，混匀后室温放置17min，510nm3波长处比色，并绘制标注准曲线。各管酚含量分别为0、5、10、20、30、40μg。2.2动力学参数确定实验取干净试管9支，编号，按表1,表2，表3正确操作。表1动力学参数测定试剂用量1试管号123456789水/mL0.04mol/L基质液/mL0.90.10.850.80.750.70.60.2-1.00.150.20.250.30.40.81.0-碳酸盐缓冲液/mL0.90.90.90.90.90.90.90.90.9pH8.8Tris缓冲溶液配制酶液/mL0.10.10.10.10.10.10.10.10.1最终基质浓度/（mmol/L）2.03.04.05.06.08.016.020.0-表2动力学参数测定试剂用量2试管号123456789水/mL0.04mol/L基质液/mL0.90.10.850.80.750.70.60.2-1.00.150.20.250.30.40.81.0-碳酸盐缓冲液/mL0.90.90.90.90.90.90.90.90.9pH=10碳酸最终基质浓钠缓冲溶液度/配制酶液/mL（mmol/L）0.12.00.10.10.10.10.10.10.10.13.0...
