细胞内细胞因子的检测VIP免费

细胞内细胞因子的检测细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。研究显示，细胞因子可以具有多重功能，作用于多个细胞亚群并可在不同亚群细胞表达。早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如Th1(IL-2，IFN-γ)与Th2(IL-4，IL-5，IL-10)，但这些研究很难推广，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还不清楚。活化的T细胞可分泌多种细胞因子至细胞外，而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原，所以应阻断细胞因子分泌至细胞外，方法为破坏高尔基体，因细胞因子（即各种蛋白）在合成后需经高尔基体的加工和转运，才能到达细胞膜，然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。因此破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径，干扰其分泌。近来，Jung与Picker采用了Brefeldin(BFA)与monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。这一方法阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。胞内细胞因子染色与传统的检测可溶性蛋白的方法如ELISA相比，具有显著优越性。该法从单个细胞水平检测内多个细胞因子的同时，还可标记各种细胞表面分化抗原以及活化分子、趋化因子受体和黏附分子等，从而区分表达特定细胞因子的细胞亚群及其表型特征。使用特定刺激剂研究细胞因子应答是细胞因子研究中的重大进展。早在1986年，Mosmann等应用Th细胞克隆技术和细胞因子产生的不同，发现小鼠CD4细胞是一个不均一的亚群，可分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。后来在人类的CD4细胞群中也发现了Th1和Th2细胞亚群。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应，在抗胞内病原菌感染中发挥重要作用；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，其主要功能是刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫有关。应用该方法，在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。本章中，我们以人外周血Th1/Th2细胞因子（IFN-γ/IL-2）的检测为例，介绍细胞内细胞因子染色的一般方法。1试剂与仪器1.1主要试剂：NaN3购自广州化学试剂厂；吐温-20为Invitrogen公司产品；Saponin购自Sigma公司；4%Paraformaldehyde自行配制；BDCytofix/CytopermPlusFixation/PermeabilizationKit（包括FixationandPermeabilizationSolution，Cat.No.554722；Perm/washBuffer（10×），Cat.No.554723；BDGolgiplugproteintransportinhibitcontainingbrefeldinA）；FACS溶血素（BDISCatalogNo.349202）。1.2主要耗材及仪器：37℃、5%CO2孵箱（Biotech）；FACS流式细胞仪（BDFACSARIA2）。1.3溶液配制：1.3.1磷酸盐缓冲液(PBS)配制：准确称量NaCl8.0g，Na2HPO41.16g，KH2PO40.2g，KCl0.2g，加入到超纯水900mL中，充分混匀，定容至1000mL，调PH值至7.2-7.4。高压灭菌20分钟，冷却后保存。1.3.2流式细胞术缓冲液配制缓冲液Ⅰ：PBS（PH：7.2-7.4）1000mL。分装为500mL/瓶，4℃保存。缓冲液Ⅱ：PBS（PH：7.2-7.4），加入1%BSA，0.05%NaN3，完全溶解后，分装500mL/瓶，4℃保存。缓冲液Ⅲ：PBS（PH：7.2-7.4），加入1%BSA，0.05%NaN3，1%Saponin，完全溶解后，分装500mL/瓶，4℃保存。1.3.3固定液（4%多聚甲醛）：准确称量多聚甲醛40g，加入PBS1000mL，加热至完全溶解，冷却后调PH为7.2-7.4，分装50mL/管离心管内-20℃保存。1.3.4试剂的选择、制备、储存：1)Phorbol12-Myristate13Acetate(PMA)(SigmaCatalogNo.P-8139)a.于DMSO中调节浓度0.1mg/mLb.分装，－20℃储存，勿反复冻融c.PMA终浓度20ng/mL细胞悬液。2)Ionomycin(sigmaCatalogNo.I-0634)a.于乙醇中配制成浓度1mg/mLb.－20℃储存c.Ionomycin终浓度1μg/mL细胞悬液3）布雷菲德菌素A，Brefeldin-A(BFA)(sigmaCatalogNo.B-7651)或BDGolgiplugTM（containingbrefeldinA,Cat.No.:555029）a.于DMSO中调...