基因组DNA的分离纯化提取方法综述VIP免费

基因组DNA的分离纯化提取方法综述中西医结合学院摘要：DNA的提取是分子生物学研究的基础技术,提取的DNA的纯度及结构完整性是进行基因工程各项研究所必需的条件。归纳基因组DNA提取的各个环节．同时对DNA提取过程中的常见问题、原因及应对策略作简要的分析综述。关键词：基因组DNA；分离；纯化；提取自20世纪50年代Watson和Crick提出DNA双螺旋模型以来,分子生物学在广度和深度上都获得空前的发展。核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。核酸样品的质量直接关系到分子生物学实验的成败。研究和应用DNA的基础是提取纯化结构完整的DNA，作为分子生物学研究的基础技术，至今建立了多样的提取纯化方法。本文针对DNA的分离纯化提取过程中所使用的不同方法进行综述。实验的一般步骤为1．破碎细胞.2．DNA的提取3．DNA的纯化第一步中破碎细胞常用有三种方法①机械法：主要通过机械切力的作用使组织细胞破碎的方法。本实验常用的器械有玻璃匀浆器。将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎。匀浆器的研钵磨球和玻璃管内壁之间间隙保持在十分之几毫米距离。此法细胞破碎程度较高，适用于量少和动物脏器组织。②化学法：有些化学药品可以改变细胞膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来。例如某些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等。实验中常用GA缓冲液，GA缓冲液中含有表面活性剂可以打开细胞的磷脂双分子层，增加通透性。且GA缓冲液是低渗溶液，细胞易吸水涨破，达到更好打开细胞的效果。特点：作用比较温和存在的问题：作用时间长，效率低；化学试剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂。③酶解法：利用各种水解酶，破碎细胞将细胞内含物释放出来。常用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)消化破碎细胞。此种方法的特点是：适用范围广；作用条件温和；内含物成分不易受到破坏。但其成本高，限制了大规模的利用且耗时较长。以上三种破碎细胞的方法可结合使用，使细胞破碎完全，利于接下来的步骤。第二步中DNA的提取有两种方法：①沉淀法实验常采用异丙醇或无水乙醇快速提取DNA一般经典酒精标本DNA提取方法都会加入蛋白酶K，且在56℃条件下消化3h以上，以达到组织中蛋白质的完全消化。得到的提取液经RNA酶处理，酚、氯仿和异戊醇反复抽提，即可得较纯的DNA产物。②介质吸附法一般介质吸附法有三种吸附材料可供选择Ⅰ.硅介质硅介质纯化提取DNA原理是：在高盐低pH值条件下结合核酸，反复漂洗，后再低盐高pH值条件下洗脱。Ⅱ.阴离子交换树脂阴离子交换树脂纯化提取DNA原理是：在低盐高pH值条件下结合核酸，高盐低pH值条件下洗脱。Ⅲ.磁珠磁珠吸附的原理是：磁性微粒挂上不同基因可吸附并携带RNA在第二步中DNA的提取的基础上进行第三步。DNA的纯化分别在两种提取方法的基础上进行。①沉淀法纯化2种沉淀纯化方法的选取Ⅰ.酚/氯仿抽提法：有机溶剂对操作人员损害较大；操作时间长Ⅱ.盐析法：操作经济，成本低但操作的时间比较长。②介质吸附法纯化反复用缓冲液漂洗后离心空甩2分钟，室温下晾干，用高pH低盐洗脱Buffer溶液洗脱。常采用柱离心式纯化方法。其优点是抽提速度快，能有效去除影响下游实验的抑制物。但是这种纯化方法价格较贵。上述即为一些常用DNA的分离纯化提取方法的综述，综合DNA的提取方法，各种提取方法也有很多相通之处，可以相互借鉴，相互结合，以达到更好的实验效果。随着生物技术的飞速发展，对这一技术的经验总结将会越来越多，更为简捷、高效的方法也必将出现，为生物技术提供更高纯度的DNA。参考文献[1]唐雪明,沈微,方惠英等.用异丙醇沉淀法快速提取质粒DNA[J].生物学通报,2002,37(1):55.DOI:10.3969/j.issn.0006-3193.2002.01.029.[2]张宁,王凤山.DNA提取方法进展[J].中国海洋药物,2004,23(2):40-46.DOI:10.3969/j.issn.1002-3461.2004.02.010.[3]周丽,李飞,魏刚等.动物DNA提取方法概述[J].畜牧与兽医,2008,40(3):66-68.[4]汤乃梅,王晓民,韩济生.一种高纯度、高得率的质粒DNA纯化法[J]生命的化学,1995,03[5]谭建明，谢桐，徐琴君，等．快速盐析法提取DNA在HLA基因分型中的应用[J]．中华器官移植杂志，1996，17(1)：9．