DNA的熔测定方法：一、圆二色谱法：钠离子条件下,端粒DNA被诱导形成反平行的G一四链体"偶氮苯衍生物加入前后,G一四链体的热稳定性如何呢?参照前一部分CD光谱实验的结果,我们选取化合物2、3和4最佳的浓度配比,利用圆二色谱仪研究了钠离子环境中所形成G一四链体在这些反式构型的偶氮苯衍生物作用下的熔点情况,从而初步研究在体系中存在钠离子条件下化合物对G一四链体的热稳定性"。1样品的配置和培育样品的配置方案:(20ul10xTris-HCI,EDTA缓冲溶液)+(20umol/L端粒序列DNAd(TTAGGG)4+(50mmol/LKCl)+(参照CD实验结果选取最佳r值的一定浓度的化合物),总体积为200ul,不足部分用水补齐，"样品的培育:首先按配置方案暂不加化合物,把配置好的含钠离子的DNA溶液,置于950C水浴中加热5分钟后,自然冷却至室温,完成DNA的退火过程,同时保证端粒DNA在钠离子作用下完全形成反平行结构的G一四链体"然后将参照CD实验结果加入一定体积10~ol/L化合物的储存液于体系中,置于4OC冰箱中培育过夜(6小时以上),以使化合物与DNA充分结合"取出离心后备用"样品的光照:需要350nm紫外光照射使偶氮苯衍生物发生异构的样品在样品测试前实施光照,光照过程及其之后测试保持在暗室中进行"。1、参数的设定:温度变化范围设定为14.5-94.5/C,升温速度设为1.5/C/min"。设定单波长扫描,波长的选定对应反式构型的化合物作用下CD光谱的结果即混合型结构G一四链体的特征吸收峰值,295nm"2、将待测样品加入圆二色谱仪专用的200ul比色皿中,放入仪器,开始扫描"3、数据经由GraphPadprism5.0工作软件处理,以温度(0C)对应CD值(mdeg)作图,得到G一四链体的熔解曲线,进行拟合计算得到对应的Tm值".钾离子环境中G-四链体的熔点首先,我们研究了未加化合物时,单纯钾离子作用下,G-四链体的熔点"如图5-9所示,295nm的CD峰值在400C之前稳定处于一个平台;之后随着温度的升高,295nm的CD峰值逐渐开始下降,即相应的G一四链体结构被逐渐打开;当温度降至800C时,CD峰值不再变化,形成一个新的平台,标志着此时G一四链体完全打开,端粒DNA呈单股链状结构"整个CD一温度曲线呈标准的”倒s型"经过数据处理,得到单纯钾离子作用下G一四链体的熔点为tm=59.40C"加入化合物1前后及35onm光照前后d(TTAGGG);在265nm的CD峰值随温度的变化曲线二、DNA熔点测定实验分别配制DNA、四种简单香豆素-DNA(摩尔比为1：5)的溶液,分别将溶液放入水浴中由400C逐渐加热到1000C,每隔50C测量一次260nm处的吸光度值,以fss=(A-A0)/(Af-A0)为纵坐标(A0和Af分别为起始吸光度和最终吸光度,A为表观吸光度),温度为横坐标作图,得到DNA的热变性温度曲线图"。三、DNA熔点测定将DNA加热到一定温度时,DNA的双螺旋就会发生裂解,DNA碱基互补的主要作用力氢键结构将被破坏,在紫外光谱中表现为260nm处吸光度的增加"通常将DNA的变性达到50%时,即增色效应达到一半时的温度称为DNA的解链温度(meltingtemPerature,Tm),Tm也称熔解温度或DNA的熔点"。小分子与DNA的相互作用能够影响Tm"嵌插作用使得DNA双螺旋结构更加稳定,Tm能增加5-8e,而沟区结合或静电结合对DNA双螺旋裂解温度影响不大，"本实验配置DNA和DNA-CAT溶液,从30oC升温至100oC,每隔2oC测定各个体系的紫外吸收强度,并以At"/A30oC对t做热变性曲线,结果如2一8所示,DNA的变性温度Tm=7肚1e"而CAI:DNA体系的变性温度Tm=8肚1e,这进一步证实儿茶素与DNA发生了嵌插作用,使得DNA双螺旋结构更加稳定"四、DNA熔点测定DNA熔点测定DNA的熔点变化被认为是研究金属离子与DNA作用强弱的重要手段,当溶液的温度升高,双螺旋DNA逐渐转化为单螺旋,同时产生减色效应。图4表明在DNA熔点测定实验中,当[Ru]/[DNA]=1B5([DNA]=80Lmol/L)时,DNA的熔点升高为518e,比较配合物[Ru(dmp)2(dpip)]2+与DNA作用的熔点变化值与经典插入试剂与DNA作用的2+熔点变化值,说明配合物[Ru(dmp)2(dpip)]与DNA之间以较强的作用力结合。五、熔点实验通常把DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA的溶解温度或熔点(Tm)。小分子与DNA的相互作用对Tm有影响，嵌插结合使得DNA双螺旋结构更加稳定，Tm会增加5～8℃，而沟槽结合或静电结合对Tm影响不明显。在Cu2+、Ca2+、Mg2+的人体生理离子浓度下，分别测定DNA、...
