整理蛋白质组学试验方法VIP免费

精品文档2、蛋白质分离的双向电泳过程2．1溶液配制常用水化上样缓冲液（Ⅰ）尿素8M4.805gCHAPS4%0.4gDTT65Mm0.098gBio-Lyte0.2%(w/v)50溴酚蓝0.001％10MilliQ水（Ⅱ）尿素7M4.2g硫脲2M1.52gCHAPS4%0.4gDTT65Mm0.098gBio-Lyte0.2%(w/v)50溴酚蓝0.001％10MilliQ水(Ⅲ)尿素5M3.0g硫脲2M1.52gSB3-102%0.2gCHAPS4%0.4gDTT65Mm0.098gBio-Lyte0.2%(w/v)50溴酚蓝0.001％10MilliQ水分成10小管，每小管1ml,-80℃冰箱保存。胶条平衡缓冲液母液尿素6M36gSDS2%2gTris-HCl0.05MpH8.83.3ml(1.5MpH8.8Tris-HCl)甘油20％20ml精品文档μl（40％）μl（1％溴酚蓝）定容至100mlμl（40％）μl（1％溴酚蓝）定容至100mlμl（40％）μl（1％溴酚蓝）定容至100ml精品文档MilliQ水定容至100ml分装成10管，-20℃冰箱保存。胶条平衡缓冲液Ⅰ胶条平衡缓冲液母液10mlDTT0.2g充分混匀，用时现配。胶条平衡缓冲液Ⅱ胶条平衡缓冲液母液10ml碘乙酰胺0.25g充分混匀，用时现配。低熔点琼脂糖封胶液低熔点琼脂糖0.5％0.5gTris25mM0.303g甘氨酸192mM1.44gSDS0.1%1ml(10%SDS)溴酚蓝0.001％100μl(1%溴酚蓝)MilliQ水定容至100ml加热溶解至澄清，室温保存。30％聚丙烯酰胺贮液丙烯酰胺150g甲叉双丙稀酰胺4gMilliQ水500ml滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。1.5mol/LTris碱pH8.8Tris碱90.75gMilliQ水400ml用1mol/LHCl调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml,4℃冰箱保存。10%SDSSDS10g精品文档精品文档MilliQ水100ml10%过硫酸铵过硫酸铵0.1gMilliQ水1ml现用现配。10×电泳缓冲液（1×＝25mMTris,192mMglycine,0.1%SDS,pH8.3）Tris碱30g甘氨酸144gSDS10gMilliQ水1L混匀后，室温保存。2．2操作步骤2.2.1第一向等电聚焦1.从冰箱中取水化上样缓冲液，室温溶解；在enpendoff管中，2.0mg蛋白干粉加入200μl水化上样缓冲液，室温下裂解3-4h；10000rpm常温离心10min,取上清液上样水化。具体的上样体积及蛋白质上样量如下表，ReadyStripIPG胶条长度7cm17cm125-250μl300-600μlTM上样体积分析型的上样量（银染）10-100ug100-300ug制备型的上样量（考马斯亮兰染色）200-500ug1-3mg2.从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条，于室温放置10min。3.沿着聚焦盘的边缘由左至右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品一定要连贯，同时注意不要产生气泡。4.用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层，分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中样品溶液上，使得胶条得正极对应于聚焦盘得正极。确保胶条与电极紧密接触，同时不要使胶条下面的溶液产生气泡。5.在每根胶条上覆盖矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。6.对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。7cm胶条水化12h（17-20℃）主动水化S1250V慢速2h除盐精品文档精品文档S2500V慢速1h除盐S31000V快速1h除盐S44000V线性3h升压S54000V快速25000伏h聚焦S6500V快速任意时间保持17cm胶条水化12h（17-20℃）主动水化S1250V慢速2h除盐S2500V慢速1h除盐S31000V快速1h除盐S48000V线性5h升压S58000V快速60,000伏h聚焦S6500V快速任意时间保持选择所放置的胶条数。设置每根胶条的极限电流。设置等电聚焦时的温度。7.聚焦结束的胶条如不立即进行平衡、第二向SDS－PAGE电泳，可将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存1-2天。2.2.2第二向SDS－PAGE电泳1.配制12％的丙稀酰胺凝胶，上部留0.5cm的空间，用MilliQ水封面，保持胶面平整。待凝胶凝固候，倒去分离胶表面的MilliQ水，再用MilliQ水冲洗。2.从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10min，使其溶解。3.在桌上先放置干得厚滤纸，聚焦好得胶条胶面朝上放在干得厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后置于胶条上，轻轻吸干胶条上得矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现得纵条纹。4.将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在槽中加入平衡缓冲液Ⅰ。将样品水化盘放在摇床上缓慢摇晃10-15min。5.第一次平衡结束后，彻底倒掉平衡缓冲液Ⅰ，将胶条竖在滤纸上，吸去多余得平衡液。再加入胶条平衡缓冲液Ⅱ，继续在摇床上缓慢摇晃10-15min。6.用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余得液...