16S_rDNA鉴定细菌的方法VIP免费

精品16SrDNA鉴定细菌的方法细菌16SrDNA鉴定主要分为7个部分：1•提取细菌基因组DNA,2•设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。6.BLAST比对获取相似片段。7.构建系统进化树试剂：1.1培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基(培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。)。1.2IMTris-HCl(pH7.4,7.6,8.0)(IL)：121.lgTris,加浓盐酸约(70ml,60ml,42ml),高温高盐灭菌后，室温保存。冷却到室温后调pH,每升高1°C,pH大约下降0.03个单位。(Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L,25°C)50ml0.lmol/L三疑甲基氨基甲烷(Tris)溶液与xml0.lmol/L盐酸混匀后，加水桥释至100ml。Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一)1.30.5MEDTA(pH8.0)(1L)：186.lgNa2EDTA・2H20,用NaOH调pH至8.0(约20g)，高温高压灭菌，室温保存。(配置方法1.称取186.lgNa2EDTA-2H20，置于1L烧杯中。2.加入约800mL的去离子水，充分搅拌。3.用NaOH调节pH值值8.0(约20gNaOH)。注意：pH值至8.0时，EDTA才能溶解。4.加去离子水将溶液定容至1L。5.适量分成小份后，高温高压灭菌。6.室温保存。)1.410XTEBuffer(缓冲液)(pH7.4,7.6,8.0)(1L)：组分：100mMTris-HCl,10mMEDTAoIMTris-HCl(pH7.4,7.6,8.0)取100ml,0.5MEDTA(pH8.0)取20ml。高温高压灭菌，室温保存。1XTEBuffer用10XTEBuffer稀释10倍即可。1.510%SDS(W/V)：称lOgSDS,689加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65°C溶解。配置时要戴口罩。6、5MNaCl：称292.2gNaCl,高温高压灭菌，49保存。7、CTAB/NaCl(10%CTAB,0.7MNaCl)：溶解4.lgNaCl,加lOgCTAB(十六烷基三甲基漠化钱)，加热搅拌。用之前在65C溶解。8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1(V/V)的比例加入异戊醇。9、酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。10、TAE缓冲液：使用液IX：0.04mol/LTris-乙酸，0.001mol/LEDTAo浓储存液50X：242gTris,57.1ml冰醋酸，100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)<>11、6X上样缓冲液(100ml)：0.25%漠酚蓝(BPB),40%蔗糖，10mmol/LEDTA(pH8.0)精品精品(0.2ml),4精品精品•C保存。12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50ml。13、EB：10mg/mlo称取lg漠化乙锭定容至100ml。棕色瓶室温避光保存。EB的工作浓度为0.5ug/mlo当配置50ml琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ulo(因EB是剧毒物质，目前很多实验室用生物荧光染料替代，常用的有Gelred等)14、蛋白酶K：20mg/ml溶于水，-209保存，反应浓度50ug/ml,反应缓冲液：0.01mol/LTris(pH7.8),0.005mol/LEDTA,5%SDS,反应温度37-56*0。无需预处理。15、RNaseA：10mg/mlo25mgRNaseA加IMTris(pH7.5)25ul,2.5MNaCl15ul,无菌水2460ul,于1009加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20-Co(为避免RNA的干扰，使用RNA酶降解基因组中的RNA。)1.1细菌基因组DNA提取基本步骤：材料准备破碎细胞或胞膜一内容物释放核算分离、纯化核酸溶解在适量缓冲液或水中基因组DNA提取所需仪器：高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光观测仪细菌基因组DNA提取方法综述细菌基因组DMA的提取方法主要有5种。不同的方法所选择的试剂会有所不同。1快速微量提取法»取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心lmin,丢去上清夜,收集菌体。>加入400ul裂解液(40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠，lmMEDTA,1%SDS,pH7.8)混匀，置于37°C水浴lhro>然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15mino>取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。>加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M,pH8.0),-20度保存1小时后,13000rpm离心15min,弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后,溶于SOulTE溶液中，置4°C保存备用。2蛋白酶/SDS法制备◊用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftiasp.◊4000rpm离心lOmin收集菌体，用WashingTE（50mmol/LTris-HClpH8.0,lOmmol/LEDTApH8.0）洗菌体2次。◊将菌体充分悬浮在5ml1XTE缓冲液中，先后加入0.5ml5mg/L的蛋白...