实验三、细胞的传代与冻存第一页,共二十页。1.细胞培养中为什么添加血清?2.使用血清需注意哪些方面?3.消化液胰酶的浓度是多少?4.使用小滤器过滤要注意哪些?第二页,共二十页。针头滤器使用应注意的问题1.拧紧滤器2.注射器吸液体3.注射器插好滤器4.对着烧杯慢推压针芯看是否漏5.如不漏对小瓶过滤。6.滤器放在小瓶瓶口上,取下针头再吸液体,反复屡次,滤完。7.检查滤器滤膜是否完好。第三页,共二十页。一、实验原理细胞贴壁过程第四页,共二十页。培养细胞一代生长过程第五页,共二十页。什么时候传代?第六页,共二十页。第七页,共二十页。细胞消化的最佳答案答案程度第八页,共二十页。细胞冻存要求冻存条件操作要点第九页,共二十页。二、实验目的掌握无菌操作技术。掌握传代细胞的培养的一般方法与步骤。掌握培养细胞的消化方法。了解在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。第十页,共二十页。三、实验材料及设备1.细胞人宫颈癌HeLa细胞人胃癌BGC-823细胞2.试剂胰酶、DMEM培养基、血清、DMSO、抗生素3.仪器超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜4.其它用品:培养瓶,试管,移液管,巴斯德吸管,废液缸,75%酒精棉球,酒精灯第十一页,共二十页。四、实验步骤1.准备:超净工作台紫外线处理30分钟,用肥皂洗手,穿鞋套,用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。2.倒置显微镜下观察细胞形态,确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置室温下预热。3.关闭超净台紫外灯,翻开可见光灯开关,翻开抽风机清洁空气,除去臭氧。用75%酒精擦双手消毒。4.正确摆放超净台内的实验用品:酒精灯、酒精棉球、新洁尔灭纱布、试管架、滴管筒〔头〕、吸管筒〔头〕、废液缸等。点燃酒精灯,准备好实验试剂:DMEM培养基〔其中血清含量10%〕、血清、胰酶等。第十二页,共二十页。第十三页,共二十页。5.点燃酒精灯;取出无菌试管,巴士德吸管和刻度吸管;安上橡皮头;过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。6.将培养用液〔90mL)瓶口用75%酒精消毒,过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。7.翻开血清〔10.5mL)瓶,瓶口过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。8.无菌吸取10mL血清参加到培养液〔90mL)中,用微量移液器参加双抗100μL轻轻混匀,配置完全培养基。9.在血清中〔剩余0.5mL)参加4mL完全培养基轻轻混匀,参加0.5mLDMSO〔冻存保护剂〕,轻轻混匀即为冻存液。第十四页,共二十页。第十五页,共二十页。10.细胞瓶口靠近火焰翻开瓶盖并在酒精灯上烧口消毒,倒掉或吸出培养基〔对于小口的培养瓶可采用倾倒方法,对于培养皿,必须用吸管吸出〕11.加一滴管胰酶轻轻漂洗一下细胞,弃胰酶,再参加一滴管或两滴管胰酶〔以盖住细胞量为准,转动培养瓶,使其湿润整个细胞层,盖好瓶盖。12.显微镜下观察细胞的消化状态,待细胞大局部收缩、突起、一半变圆,细胞边界清晰时,即可立起或翻转培养瓶停止消化,在超净台内靠近火焰处弃胰酶第十六页,共二十页。13.加两滴管〔约1.8-2mL〕冻存液既全面吹打细胞瓶壁,吹打均匀,细胞浓度宜大,3×106个/mL左右。将细胞悬液吸至冻存管中,拧好盖,封好胶布,并标记好细胞种类,冻存时间,保存条件以及冻存者姓名等〔悬浮细胞冻存将细胞离心后再加冻存液〕在培养瓶(剩余少量细胞〕中参加5mL完全培养及,盖好瓶盖〔拧紧后并旋回半圈〕。做好记录,倒置相差显微镜下观察细胞的形态,放入CO2培养箱培养。冻存管在4度以下存放30min,转放到-20度1.5-2h,再转到-70度4-12h后即可转移到液氮内,注意做好冻存记录。第十七页,共二十页。把握好传代时机,80-90%集合度阶段最好,过早细胞产量少,过晚细胞健康状态不佳消化时间要适度,过短细胞不易脱落,过长细胞可脱落流失。消化液浓度要适宜,过浓时消化作用强烈,细胞反响快,所需消化时间短,掌握不好,细胞易流失。不同细胞对消化反响不同。贴壁不牢—直接吹下—细胞损伤本卷须知第十八页,共二十页。1.试述传代培养的步骤和本卷须知,并指出哪些是关键步骤?2.细胞胞传代培养的目的是什么?3.贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同?4.如何估计是否传代和传代的方式?5.细胞冻存应注意的问题。...