MTT法检测细胞活力甘肃中医药大学第一页，共二十四页。MTT法目的和意义检测细胞存活和生长情况用于评价药物产生的细胞毒作用第二页，共二十四页。原理•四唑盐〔噻唑蓝〕是一种能接受氢原子的染料，简称MTT•活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT复原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜〔DMSO〕能溶解细胞中的紫蓝色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，从而反映细胞的增殖情况。•在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与活细胞数成正比。第三页，共二十四页。活细胞+MTT琥珀酸脱氢酶紫蓝色结晶物Formazan第四页，共二十四页。贴壁细胞操作步骤1.接种细胞：用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔2000-3000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积90ul。〔边缘孔用PBS或空白培养基填充〕。2.培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养，至细胞单层铺满孔底〔96孔平底板，大约12h〕，参加浓度梯度的药物。原那么上，细胞贴壁后即可加药，每孔加药10ul，一般设5个复孔。3.5%CO2，37℃孵育分别孵育24小时后，倒置显微镜下观察。第五页，共二十四页。4.每孔参加10ulMTT溶液〔5mg/ml，即0.5%MTT〕，继续培养4h。假设药物与MTT能够反响，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再参加含MTT的培养液。5.终止培养，小心吸去孔内培养液。6.每孔参加100ul二甲基亚砜〔置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。7.同时设置调零孔〔培养基、MTT、二甲基亚砜〕，对照孔〔细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜〕第六页，共二十四页。悬浮细胞操作步骤：•1〕将细胞离心收集后，调节细胞悬液浓度大约1×104/ml，每孔先加细胞悬液90ul,相应梯度的药物每孔10ul；共100ul参加到96孔板〔边缘孔用PBS填充〕。每板设对照。同时设置调零孔〔培养基、MTT、二甲基亚砜〕，对照孔〔细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜〕，每组设5个复孔。•2〕置37℃，5%CO2孵育24小时，倒置显微镜下观察。•3〕每孔参加10ulMTT溶液〔5mg/ml，即0.5%MTT〕，继续培养4h•4〕每孔加三联裂解液〔10gSDS，异丁醇5ml，10MHCl0.1ml用双蒸水溶解配成100ml〕过夜，第二天早晨置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm测量各孔的吸光值。第七页，共二十四页。药物的配制•浓度•体积•过滤第八页，共二十四页。MTT的配制•MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，防止反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。•MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，因为时间较短。第九页，共二十四页。实验结果统计学处理•所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线曲线，专门公式求IC50〔半数抑制浓度〕。或计算抑制率。•OD对照组-OD实验组•抑制率%=•OD对照组×100%第十页，共二十四页。实验结果统计学处理公式如下：lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg最大剂量I:lg(最大剂量/相临剂量)P:阳性反响率之和Pm:最大阳性反响率Pn:最小阳性反响率第十一页，共二十四页。举例•药物浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001umol/l，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式：Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025第十二页，共二十四页。本卷须知1．选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。2．设空白对照，与试验平行设不加细胞只加...
